Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Sanger dizilemesi, in vitro DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından zincir sonlandırıcı dideoksinükleotidlerin seçici bir şekilde dahil edilmesine dayanan bir DNA dizileme yöntemidir. İlk olarak 1977'de Frederick Sanger ve meslektaşları tarafından geliştirildikten sonra, yaklaşık 40 yıldır en yaygın kullanılan dizileme yöntemi haline geldi. İlk olarak 1986 yılında Applied Biosystems tarafından ticarileştirildi. Daha yakın zamanlarda, daha yüksek hacimli Sanger dizilemesi, özellikle büyük ölçekli, otomatik genom analizleri için "Gelecek-Nesil" dizileme yöntemleriyle değiştirildi. Bununla birlikte, Sanger yöntemi, daha küçük ölçekli projeler ve Gelecek-Nesil sonuçların doğrulanması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yine de, kısa okumalı dizileme teknolojilerine (Illumina gibi) göre, >500 nükleotidlik DNA dizisi okumaları üretebilme avantajına sahiptir.
Yöntem
Klasik zincir sonlandırma yöntemi, tek sarmallı bir DNA şablonu, bir DNA primeri, bir DNA polimeraz, normal deoksinükleotidtrifosfatlar (dNTPs) ve modifiye di-deoksinükleotidtrifosfatlar (ddNTPs) gerektirir, bunlardan ikincisi DNA sarmalının uzamasını sonlandırır. Bu zincir sonlandırıcı nükleotidler, iki nükleotid arasında bir fosfodiester bağının oluşumu için gerekli olan bir 3'-OH grubundan yoksundur, bu da DNA polimerazın, modifiye bir ddNTP dahil edildiğinde DNA'nın uzamasını durdurmasına neden olur. DdNTP'ler, otomatik dizileme makinelerinde tespit için radyoaktif olarak veya floresan olarak etiketlenebilir.
DNA örneği, standart deoksinükleotidlerin dördünü (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP) ve DNA polimerazı içeren dört ayrı dizileme reaksiyonuna bölünmüştür. Her reaksiyona dört dideoksinükleotidden (ddATP, ddGTP, ddCTP veya ddTTP) sadece biri eklenirken, eklenen diğer nükleotidler sıradan olanlardır. Tam diziyi hala kopyalarken yeterli fragmanın üretilmesine izin vermek için deoksinükleotid konsantrasyonu (örn. 0,5 mM dTTP: 0,005 mM ddTTP), karşılık gelen dideoksinükleotidinkinden yaklaşık 100 kat daha yüksek olmalıdır (ancak ddNTP konsantrasyonu aynı zamanda istenen dizi uzunluğuna da bağlıdır). Daha mantıklı bir sıraya koyarsak, bu süreçte dört ddNTP'nin tümünü test etmek için dört ayrı reaksiyona ihtiyaç vardır. Bağlı primerden şablon DNA uzatma turlarının ardından, elde edilen DNA fragmanları ısıyla denatüre edilir ve jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır. 1977 tarihli orijinal yayında, baz çiftli ssDNA döngülerinin oluşumu, bazı yerlerde bantları çözmede ciddi zorlukların bir sebebiydi. Bu sıklıkla denatüre edici bir poliakrilamid-üre jeli kullanılarak gerçekleştirilir ve dört reaksiyonun her biri dört ayrı şeritten birinde (A, T, G, C şeritleri) yürütülür. DNA bantları daha sonra otoradyografi veya UV ışığı ile görselleştirilebilir ve DNA dizisi doğrudan X-ışını filmi veya jel görüntüsünden okunabilir.
Sağdaki görüntüde, X-ışını filmi jele maruz bırakıldı ve koyu bantlar, farklı uzunluklardaki DNA fragmanlarına karşılık geliyor. Bir şeritteki koyu bir bant, bir dideoksinükleotidin (ddATP, ddGTP, ddCTP veya ddTTP) dahil edilmesinden sonra zincir sonlandırmasının sonucu olan bir DNA parçasını belirtir. Aşağıdan yukarıya dört şerit arasındaki farklı bantların göreceli konumları daha sonra DNA dizisini okumak için kullanılır.
Zincir sonlandırma dizilemesinin teknik varyasyonları arasında radyoaktif etiketleme için radyoaktif fosfor içeren nükleotidlerle etiketleme veya 5'ucunda bir floresan boya ile etiketlenmiş bir primer kullanılması yer alır. Boya astar dizilemesi, daha hızlı ve daha ekonomik analiz ve otomasyon için optik bir sistemde okumayı kolaylaştırır. Leroy Hood ve floresan etiketli ddNTP'ler ve primerlerin iş arkadaşları tarafından yapılan sonraki geliştirme, otomatikleştirilmiş, yüksek verimli DNA dizilimi için zemin hazırladı.
Zincir sonlandırma yöntemleri, DNA dizilimini büyük ölçüde basitleştirmiştir. Örneğin, zincir sonlandırmaya dayalı kitler, dizileme için gerekli reaktifleri içeren, önceden bölünmüş ve kullanıma hazır olan ticari olarak mevcuttur. Sınırlamalar arasında primerin DNA'ya spesifik olmayan bağlanması, DNA dizisinin doğru okunmasını ve dizinin doğruluğunu etkileyen DNA sekonder yapıları bulunur.
Boya-sonlandırıcı dizilemesi
Boya sonlandırıcı dizilemesi, etiketli primer yöntemindeki gibi dört reaksiyon yerine tek bir reaksiyonda dizilemeye izin veren zincir sonlandırıcı ddNTP'lerin etiketlemesini kullanır. Boya sonlandırıcı dizilemede, dört dideoksinükleotid zincir sonlandırıcıdan her biri, her biri farklı dalga boylarında ışık yayan floresan boyalarla etiketlenir.
Daha uygunluğu ve hızı sayesinde, boya sonlandırıcı dizileme artık otomatik dizilemede temel dayanaktır. Sınırlamaları, boya etiketli zincir sonlandırıcıların DNA fragmanına dahil edilmesindeki farklılıklardan kaynaklanan boya etkilerini içerir, bu da kılcal elektroforezden sonra elektronik DNA dizisi izleme kromatogramında eşit olmayan tepe yükseklikleri ve şekilleriyle sonuçlanır.
Bu sorun, "boya lekelerini" ortadan kaldırmak için yöntemlerin yanı sıra, dahil etme değişkenliğini en aza indiren modifiye edilmiş DNA polimeraz enzim sistemleri ve boyalarının kullanılmasıyla ele alınmıştır. Boya sonlandırıcı dizileme yöntemi, otomatik yüksek verimli DNA dizisi analizörleriyle birlikte, Gelecek-Nesil Dizileme'nin tanıtımına kadar dizileme projelerinin büyük çoğunluğunda kullanıldı.
Otomasyon ve örnek hazırlama
Otomatik DNA dizileme cihazları (DNA sıralayıcılar), tek bir grupta 384'e kadar DNA örneğini sıralayabilir. Toplu çalıştırmalar günde 24 defaya kadar gerçekleşebilir. DNA sıralayıcıları kılcal elektroforez kullanarak şeritleri boyuta (veya uzunluğa) göre ayırır, boya floresansını tespit eder ve kaydeder ve flüoresan tepe izleme kromatogramları olarak çıktı verileri. Örnekleri sıralayıcıya yüklemeden önce, bir tampon solüsyonunda örneklerin dizileme reaksiyonları (ısıl döngü ve etiketleme), temizlenmesi ve yeniden süspansiyonu ayrı ayrı gerçekleştirilir. Bir dizi ticari ve ticari olmayan yazılım paketi, düşük kaliteli DNA izlerini otomatik olarak kesebilir. Bu programlar her zirvenin kalitesini puanlar ve düşük kaliteli temel zirveleri kaldırır (genellikle dizinin sonlarında bulunur). Bu tür algoritmaların doğruluğu, bir insan operatör tarafından yapılan görsel incelemeden daha düşüktür, ancak büyük sıralı veri setlerinin otomatik olarak işlenmesi için yeterlidir.
Zorluklar
Sanger yöntemiyle DNA dizilemesinin yaygın zorlukları, primer bağlanması nedeniyle dizinin ilk 15-40 bazında düşük kaliteyi ve 700-900 bazdan sonra dizileme izlerinin kalitesinin bozulmasını içerir. Phred gibi temel arama yazılımı, tipik olarak, dizilerin düşük kaliteli bölgelerinin kırpılmasına yardımcı olmak için bir kalite tahmini sağlar.
DNA fragmanlarının dizilemeden önce klonlandığı durumlarda, ortaya çıkan dizi, klonlama vektörünün parçalarını içerebilir. Bunun aksine, PCR tabanlı klonlama ve piroz sıraya dayalı yeni nesil dizileme teknolojileri genellikle klonlama vektörlerini kullanmaktan kaçınır. Son zamanlarda, Ampliseq ve SeqSharp gibi tek adımlı Sanger dizileme (kombine amplifikasyon ve dizileme) yöntemleri, klonlama veya önceden amplifikasyon olmadan hedef genlerin hızlı dizilemesine izin veren geliştirilmiştir.
Mevcut yöntemler, tek bir reaksiyonda yalnızca nispeten kısa (300-1000 nükleotid uzunluğunda) DNA parçalarını doğrudan sıralayabilir. Bu boyut sınırının üzerindeki DNA fragmanlarının sıralanmasının önündeki ana engel, uzunlukları sadece bir nükleotid kadar farklılık gösteren büyük DNA fragmanlarını çözmek için yetersiz ayırma gücüdür.
Mikroakışkan Sanger dizilemesi
Sanger dizileme adımlarının (termal döngü, örnek saflaştırma ve kapiler elektroforez) nanolitre ölçekli örnek hacimleri kullanılarak wafer-ölçekli bir çip üzerine entegre edildiği, DNA dizilemesi için bir çip üzerinde laboratuvar uygulamasıdır. Bu teknoloji, Sanger dizileme adımlarını entegre ederek ve otomatikleştirerek geleneksel Sanger yönteminin (örn. pahalı reaktiflerin yüksek tüketimi, pahalı ekipmanlara güvenme, personel yoğun manipülasyonlar, vb.) birçok önemli eksikliğini ortadan kaldırırken, uzun ve doğru dizi okumaları üretir.
Modern başlangıcında, yüksek verimli genom dizilimi, genomun küçük tek sarmallı parçalara bölünmesini ve ardından parçaların Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile amplifikasyonunu içerir. Sanger yöntemini benimseyen her DNA fragmanı, flüoresan olarak etiketlenmiş bir dideoksi zincirini sonlandıran nükleotidin dahil edilmesiyle geri döndürülemez bir şekilde sonlandırılır, böylece her biri uzunluğu bir baz ile farklılık gösteren ve terminal bazında baza özgü bir floresan etiket taşıyan bir DNA fragmanları üretir. Güçlendirilmiş baz merdivenleri daha sonra, parçaların sıralı bir dizisini sağlayan floresan etiketli ssDNA parçalarının otomatik, yerinde "bitiş çizgisi" tespiti ile Kapiler Dizi Elektroforezi ile ayrılır. Bu dizi okumaları daha sonra bilgisayar, tam olarak birleştirildikten sonra tam genomik diziye benzeyen üst üste binen veya bitişik dizilemeler ("contigs" olarak adlandırılır) halinde birleştirilir.
Sanger yöntemleri, yaklaşık 800bp'lik okuma uzunluklarına ulaşır (tipik olarak zenginleştirilmemiş DNA ile 500-600bp). Sanger yöntemlerinde daha uzun okuma uzunlukları, diğer dizileme yöntemlerine göre, özellikle genomun tekrarlayan bölgelerinin dizilenmesi açısından önemli avantajlar sergilemektedir. Kısa okunan dizi verilerinin zorluğu, özellikle yeni genomların (de novo) dizilemesinde ve yüksek düzeyde yeniden düzenlenmiş genom bölümlerinin, tipik olarak kanser genomlarında veya yapısal varyasyon sergileyen kromozom bölgelerinde görülenlerin dizilemesinde bir sorundur.
Mikroakışkan dizileme teknolojilerinin uygulamaları
DNA dizilemesinin diğer yararlı uygulamaları arasında tek nükleotid polimorfizm saptama, tek sarmallı konformasyon polimorfizm heterodubleks analizi ve kısa tandem tekrar analizi yer alır. DNA parçalarının boyut ve/veya konformasyon farklılıklarına göre çözümlenmesi, genomun bu özelliklerinin incelenmesinde en kritik adımdır.
Cihaz tasarımı
Sıralama çipi, 100 mm çapında üç cam gofret ve bir polidimetilsiloksan membrandan oluşan dört katmanlı bir yapıya sahiptir. Reaksiyon odaları ve kapiler elektroforez kanalları, termal olarak bağlanmış en üstteki iki cam wafer (hangi cihaz öğelerinin mikrofabrike olduğu) arasında oyulmuştur. Üç boyutlu kanal ara bağlantıları ve mikrovalfler, PDMS ve alt manifold cam yonga plakası tarafından oluşturulur.
Cihaz, her biri Sanger dizileme adımlarına karşılık gelen üç işlevsel birimden oluşur. Termal-döngü ünitesi, entegre dirençli sıcaklık dedektörü, mikrovalfler ve bir yüzey ısıtıcısı olan 250 nanolitre reaksiyon odasıdır. Reaktifin en üstteki tüm cam katman ile alt cam-PDMS katmanı arasındaki hareketi, 500 µm çaplı geçiş delikleri aracılığıyla gerçekleşir. Termal-döngüden sonra, reaksiyon karışımı yakalama/saflaştırma bölmesinde saflaştırmaya tabi tutulur ve ardından kapiler elektroforez bölmesine enjekte edilir. CE ünitesi, 65 μm genişliğindeki dönüşlerle kompakt bir geri dönüş düzenine katlanan 30 cm'lik bir kapilerden oluşur.
Dizileme kimyası
Termal-döngü
Termal-döngü reaksiyon odasında, boya sonlandırıcı sekanslama reaktifi, şablon DNA ve primerler, termal-döngü odasına yüklenir ve 35 döngü boyunca termal döngü yapılır (95 °C'de 12 saniye ve 60 °C'de 55 saniye).
Arıtma
Yüklenen reaksiyon karışımı (uzatma parçaları, şablon DNA ve fazla dizileme reaktifi içerir), yakalama çıkışı ve giriş delikleri arasına uygulanan 33 Volt/cm'lik bir elektrik alanı aracılığıyla 30 °C'de bir yakalama/saflaştırma bölmesinden geçirilir. Örneğin sürüldüğü yakalama jeli, bir poliakrilamid matrisine kovalent olarak bağlanmış 40 μM oligonükleotidden (primerleri tamamlayıcı) oluşur. Uzatma fragmanları, jel matris ile hareketsizleştirilir ve fazla primer, şablon, serbest nükleotitler ve tuzlar, yakalama atık portu yoluyla elüte edilir. Yakalama jeli, uzatma parçalarını serbest bırakmak için 67-75 °C'ye ısıtılır.
Kapiler elektroforez
Uzatma fragmanları, 125-167-V/cm alan aracılığıyla elektroforeze tabi tutuldukları kapiler-elektrofez bölmesine enjekte edilir.
Platformlar
Apollo 100 platformu, ilk iki Sanger sıralama adımını (termal-döngü ve arıtma) tam otomatik bir sistemde birleştirir. Üretici, örneklerin ve reaktiflerin sisteme yüklenmesinin ardından üç saat içinde kapiler elektroforez için hazır olduğunu iddia ediyor. Apollo 100 platformu, mikrolitre altı reaktif hacmi gerektirir.
Diğer dizileme teknikleriyle karşılaştırmalar
| Teknoloji | Şerit sayısı | Enjeksiyon hacmi (nL) | Analiz süresi | Ortalama okuma uzunluğu | Çıktı (analiz dahil;Mb/sa ) | Jel dökülmesi | Şerit takibi |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Döşeme jeli | 96 | 500-1000 | 6-8 saat | 700 bp | 0,0672 | Evet | Evet |
| Kapiler dizi elektroforezi | 96 | 1-5 | 1-3 saat | 700 bp | 0.166 | Hayır | Hayır |
| Mikroçip | 96 | 0.1-0.5 | 6-30 dakika | 430 bp | 0.660 | Hayır | Hayır |
| 454/Roche FLX (2008) | <0.001 | 4 saat | 200-300 bp | 20-30 | |||
| Illumina/Solexa (2008) | 2-3 gün | 30-100 bp | 20 | ||||
| ABI/SOLiD (2008) | 8 gün | 35 bp | 5-15 | ||||
| Illumina MiSeq (2019) | 1-3 gün | 2x75-2x300 bp | 170-250 | ||||
| Illumina NovaSeq (2019) | 1-2 gün | 2x50-2x150 bp | 22.000-67.000 | ||||
| Ion Torrent Ion 530 (2019) | 2,5-4 saat | 200-600 bp | 110-920 | ||||
| BGI MGISEQ-T7 (2019) | 1 gün | 2x150 bp | 250.000 | ||||
| Pacific Biosciences SMRT (2019) | 10-20 saat | 10–30 kb | 1.300 | ||||
| Oxford Nanopore MinIon (2019) | 3 gün | 13–20 kb | 700 |
Yüksek verimli dizilimin nihai amacı, düşük maliyetli ve uzun okuma uzunlukları elde etmede son derece verimli sistemler geliştirmektir. Her bir elektroforetik ayırmanın daha uzun okuma uzunlukları, de novo DNA dizilemesi ile ilişkili maliyeti ve belirli bir artıklıkta DNA bileşenlerini dizilemek için gereken şablon sayısını önemli ölçüde azaltır. Mikroakışkanlar daha hızlı, daha ucuz ve daha kolay dizi montajına izin verebilir.
Kaynakça
- ^ Sanger F; Coulson AR (Mayıs 1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J. Mol. Biol. 94 (3): 441-8. doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2. (PMID) 1100841.
- ^ a b c Sanger F; Nicklen S; Coulson AR (Aralık 1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463-7. Bibcode:1977PNAS...74.5463S. doi:10.1073/pnas.74.12.5463. (PMC) 431765 $2. (PMID) 271968.
- ^ Adams, Jill U. (2008). . Nature Education. 19 Ekim 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 24 Ekim 2019.
- ^ Smith LM; Sanders JZ; Kaiser RJ; Hughes, Peter; Dodd, Chris; Connell, Charles R.; Heiner, Cheryl; Kent, Stephen B. H.; Hood, Leroy E. (1986). "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis". Nature. 321 (6071): 674-9. Bibcode:1986Natur.321..674S. doi:10.1038/321674a0. (PMID) 3713851.
- ^ Smith LM; Fung S; Hunkapiller MW; Hunkapiller TJ; Hood LE (Nisan 1985). "The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5' terminus: synthesis of fluorescent DNA primers for use in DNA sequence analysis". Nucleic Acids Res. 13 (7): 2399-412. doi:10.1093/nar/13.7.2399. (PMC) 341163 $2. (PMID) 4000959.
- ^ . 15 Aralık 2001 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 24 Şubat 2011.
- ^ Ledergerber, C; Dessimoz, C (2011). "Base-calling for next-generation sequencing platforms". Briefings in Bioinformatics. 12 (5): 489-97. doi:10.1093/bib/bbq077. (PMC) 3178052 $2. (PMID) 21245079.
- ^ Murphy, K.; Berg, K.; Eshleman, J. (2005). "Sequencing of genomic DNA by combined amplification and cycle sequencing reaction". Clinical Chemistry. 51 (1): 35-39. doi:10.1373/clinchem.2004.039164. (PMID) 15514094.
- ^ Sengupta, D. .; Cookson, B. . (2010). "SeqSharp: A general approach for improving cycle-sequencing that facilitates a robust one-step combined amplification and sequencing method". The Journal of Molecular Diagnostics. 12 (3): 272-277. doi:10.2353/jmoldx.2010.090134. (PMC) 2860461 $2. (PMID) 20203000.
- ^ a b c Kan, Cheuk-Wai; Fredlake, Christopher P.; Doherty, Erin A. S.; Barron, Annelise E. (1 Kasım 2004). "DNA sequencing and genotyping in miniaturized electrophoresis systems". Electrophoresis. 25 (21–22): 3564-3588. doi:10.1002/elps.200406161. (PMID) 15565709.
- ^ a b Morozova, Olena; Marra, Marco A (2008). "Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics". Genomics. 92 (5): 255-64. doi:10.1016/j.ygeno.2008.07.001. (PMID) 18703132.
- ^ Microchip Biologies Inc. Apollo 100 28 Ağustos 2008 tarihinde Wayback Machine sitesinde .
- ^ Sinville, Rondedrick; Soper, Steven A (2007). "High resolution DNA separations using microchip electrophoresis". Journal of Separation Science. 30 (11): 1714-28. doi:10.1002/jssc.200700150. (PMID) 17623451.
- ^ Kumar, Kishore; Cowley, Mark; Davis, Ryan (2019). "Next-Generation Sequencing and Emerging Technologies". Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (7): 661-673. doi:10.1055/s-0039-1688446. ISSN 0094-6176. (PMID) 31096307.
- ^ Tyson (2018). "MinION-based long-read sequencing and assembly extends the Caenorhabditis elegans reference genome". Genome Research. 28 (2): 266-274. doi:10.1101/gr.221184.117. ISSN 1088-9051. (PMC) 5793790 $2. (PMID) 29273626.
wikipedia, wiki, viki, vikipedia, oku, kitap, kütüphane, kütübhane, ara, ara bul, bul, herşey, ne arasanız burada,hikayeler, makale, kitaplar, öğren, wiki, bilgi, tarih, yukle, izle, telefon için, turk, türk, türkçe, turkce, nasıl yapılır, ne demek, nasıl, yapmak, yapılır, indir, ücretsiz, ücretsiz indir, bedava, bedava indir, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, resim, müzik, şarkı, film, film, oyun, oyunlar, mobil, cep telefonu, telefon, android, ios, apple, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, pc, web, computer, bilgisayar
Sanger dizilemesi in vitro DNA replikasyonu sirasinda DNA polimeraz tarafindan zincir sonlandirici dideoksinukleotidlerin secici bir sekilde dahil edilmesine dayanan bir DNA dizileme yontemidir Ilk olarak 1977 de Frederick Sanger ve meslektaslari tarafindan gelistirildikten sonra yaklasik 40 yildir en yaygin kullanilan dizileme yontemi haline geldi Ilk olarak 1986 yilinda Applied Biosystems tarafindan ticarilestirildi Daha yakin zamanlarda daha yuksek hacimli Sanger dizilemesi ozellikle buyuk olcekli otomatik genom analizleri icin Gelecek Nesil dizileme yontemleriyle degistirildi Bununla birlikte Sanger yontemi daha kucuk olcekli projeler ve Gelecek Nesil sonuclarin dogrulanmasi icin yaygin olarak kullanilmaktadir Yine de kisa okumali dizileme teknolojilerine Illumina gibi gore gt 500 nukleotidlik DNA dizisi okumalari uretebilme avantajina sahiptir DNA dizilemesi icin Sanger zincir sonlandirma yontemiYontemFloresan ddNTP molekulleri Klasik zincir sonlandirma yontemi tek sarmalli bir DNA sablonu bir DNA primeri bir DNA polimeraz normal deoksinukleotidtrifosfatlar dNTPs ve modifiye di deoksinukleotidtrifosfatlar ddNTPs gerektirir bunlardan ikincisi DNA sarmalinin uzamasini sonlandirir Bu zincir sonlandirici nukleotidler iki nukleotid arasinda bir fosfodiester baginin olusumu icin gerekli olan bir 3 OH grubundan yoksundur bu da DNA polimerazin modifiye bir ddNTP dahil edildiginde DNA nin uzamasini durdurmasina neden olur DdNTP ler otomatik dizileme makinelerinde tespit icin radyoaktif olarak veya floresan olarak etiketlenebilir DNA ornegi standart deoksinukleotidlerin dordunu dATP dGTP dCTP ve dTTP ve DNA polimerazi iceren dort ayri dizileme reaksiyonuna bolunmustur Her reaksiyona dort dideoksinukleotidden ddATP ddGTP ddCTP veya ddTTP sadece biri eklenirken eklenen diger nukleotidler siradan olanlardir Tam diziyi hala kopyalarken yeterli fragmanin uretilmesine izin vermek icin deoksinukleotid konsantrasyonu orn 0 5 mM dTTP 0 005 mM ddTTP karsilik gelen dideoksinukleotidinkinden yaklasik 100 kat daha yuksek olmalidir ancak ddNTP konsantrasyonu ayni zamanda istenen dizi uzunluguna da baglidir Daha mantikli bir siraya koyarsak bu surecte dort ddNTP nin tumunu test etmek icin dort ayri reaksiyona ihtiyac vardir Bagli primerden sablon DNA uzatma turlarinin ardindan elde edilen DNA fragmanlari isiyla denature edilir ve jel elektroforezi kullanilarak boyuta gore ayrilir 1977 tarihli orijinal yayinda baz ciftli ssDNA dongulerinin olusumu bazi yerlerde bantlari cozmede ciddi zorluklarin bir sebebiydi Bu siklikla denature edici bir poliakrilamid ure jeli kullanilarak gerceklestirilir ve dort reaksiyonun her biri dort ayri seritten birinde A T G C seritleri yurutulur DNA bantlari daha sonra otoradyografi veya UV isigi ile gorsellestirilebilir ve DNA dizisi dogrudan X isini filmi veya jel goruntusunden okunabilir Radyoaktif olarak etiketlenmis dizileme jelinin parcasi Sagdaki goruntude X isini filmi jele maruz birakildi ve koyu bantlar farkli uzunluklardaki DNA fragmanlarina karsilik geliyor Bir seritteki koyu bir bant bir dideoksinukleotidin ddATP ddGTP ddCTP veya ddTTP dahil edilmesinden sonra zincir sonlandirmasinin sonucu olan bir DNA parcasini belirtir Asagidan yukariya dort serit arasindaki farkli bantlarin goreceli konumlari daha sonra DNA dizisini okumak icin kullanilir DNA fragmanlari primer 1 uzerinde radyoaktif veya floresan bir etiketle yeni DNA zincirinde etiketli bir dNTP ile veya etiketli bir ddNTP ile etiketlenir Zincir sonlandirma dizilemesinin teknik varyasyonlari arasinda radyoaktif etiketleme icin radyoaktif fosfor iceren nukleotidlerle etiketleme veya 5 ucunda bir floresan boya ile etiketlenmis bir primer kullanilmasi yer alir Boya astar dizilemesi daha hizli ve daha ekonomik analiz ve otomasyon icin optik bir sistemde okumayi kolaylastirir Leroy Hood ve floresan etiketli ddNTP ler ve primerlerin is arkadaslari tarafindan yapilan sonraki gelistirme otomatiklestirilmis yuksek verimli DNA dizilimi icin zemin hazirladi Floresan zirvelerine kiyasla radyoaktif dizileme ile dizileme merdiveni Zincir sonlandirma yontemleri DNA dizilimini buyuk olcude basitlestirmistir Ornegin zincir sonlandirmaya dayali kitler dizileme icin gerekli reaktifleri iceren onceden bolunmus ve kullanima hazir olan ticari olarak mevcuttur Sinirlamalar arasinda primerin DNA ya spesifik olmayan baglanmasi DNA dizisinin dogru okunmasini ve dizinin dogrulugunu etkileyen DNA sekonder yapilari bulunur Boya sonlandirici dizilemesi Kapiler elektroforez Boya sonlandirici dizilemesi etiketli primer yontemindeki gibi dort reaksiyon yerine tek bir reaksiyonda dizilemeye izin veren zincir sonlandirici ddNTP lerin etiketlemesini kullanir Boya sonlandirici dizilemede dort dideoksinukleotid zincir sonlandiricidan her biri her biri farkli dalga boylarinda isik yayan floresan boyalarla etiketlenir Daha uygunlugu ve hizi sayesinde boya sonlandirici dizileme artik otomatik dizilemede temel dayanaktir Sinirlamalari boya etiketli zincir sonlandiricilarin DNA fragmanina dahil edilmesindeki farkliliklardan kaynaklanan boya etkilerini icerir bu da kilcal elektroforezden sonra elektronik DNA dizisi izleme kromatograminda esit olmayan tepe yukseklikleri ve sekilleriyle sonuclanir Bu sorun boya lekelerini ortadan kaldirmak icin yontemlerin yani sira dahil etme degiskenligini en aza indiren modifiye edilmis DNA polimeraz enzim sistemleri ve boyalarinin kullanilmasiyla ele alinmistir Boya sonlandirici dizileme yontemi otomatik yuksek verimli DNA dizisi analizorleriyle birlikte Gelecek Nesil Dizileme nin tanitimina kadar dizileme projelerinin buyuk cogunlugunda kullanildi Otomasyon ve ornek hazirlama Ornek bir boya sonlandiricinin baslangicinin gorunumu Otomatik DNA dizileme cihazlari DNA siralayicilar tek bir grupta 384 e kadar DNA ornegini siralayabilir Toplu calistirmalar gunde 24 defaya kadar gerceklesebilir DNA siralayicilari kilcal elektroforez kullanarak seritleri boyuta veya uzunluga gore ayirir boya floresansini tespit eder ve kaydeder ve fluoresan tepe izleme kromatogramlari olarak cikti verileri Ornekleri siralayiciya yuklemeden once bir tampon solusyonunda orneklerin dizileme reaksiyonlari isil dongu ve etiketleme temizlenmesi ve yeniden suspansiyonu ayri ayri gerceklestirilir Bir dizi ticari ve ticari olmayan yazilim paketi dusuk kaliteli DNA izlerini otomatik olarak kesebilir Bu programlar her zirvenin kalitesini puanlar ve dusuk kaliteli temel zirveleri kaldirir genellikle dizinin sonlarinda bulunur Bu tur algoritmalarin dogrulugu bir insan operator tarafindan yapilan gorsel incelemeden daha dusuktur ancak buyuk sirali veri setlerinin otomatik olarak islenmesi icin yeterlidir Zorluklar Sanger yontemiyle DNA dizilemesinin yaygin zorluklari primer baglanmasi nedeniyle dizinin ilk 15 40 bazinda dusuk kaliteyi ve 700 900 bazdan sonra dizileme izlerinin kalitesinin bozulmasini icerir Phred gibi temel arama yazilimi tipik olarak dizilerin dusuk kaliteli bolgelerinin kirpilmasina yardimci olmak icin bir kalite tahmini saglar DNA fragmanlarinin dizilemeden once klonlandigi durumlarda ortaya cikan dizi klonlama vektorunun parcalarini icerebilir Bunun aksine PCR tabanli klonlama ve piroz siraya dayali yeni nesil dizileme teknolojileri genellikle klonlama vektorlerini kullanmaktan kacinir Son zamanlarda Ampliseq ve SeqSharp gibi tek adimli Sanger dizileme kombine amplifikasyon ve dizileme yontemleri klonlama veya onceden amplifikasyon olmadan hedef genlerin hizli dizilemesine izin veren gelistirilmistir Mevcut yontemler tek bir reaksiyonda yalnizca nispeten kisa 300 1000 nukleotid uzunlugunda DNA parcalarini dogrudan siralayabilir Bu boyut sinirinin uzerindeki DNA fragmanlarinin siralanmasinin onundeki ana engel uzunluklari sadece bir nukleotid kadar farklilik gosteren buyuk DNA fragmanlarini cozmek icin yetersiz ayirma gucudur Mikroakiskan Sanger dizilemesiSanger dizileme adimlarinin termal dongu ornek saflastirma ve kapiler elektroforez nanolitre olcekli ornek hacimleri kullanilarak wafer olcekli bir cip uzerine entegre edildigi DNA dizilemesi icin bir cip uzerinde laboratuvar uygulamasidir Bu teknoloji Sanger dizileme adimlarini entegre ederek ve otomatiklestirerek geleneksel Sanger yonteminin orn pahali reaktiflerin yuksek tuketimi pahali ekipmanlara guvenme personel yogun manipulasyonlar vb bircok onemli eksikligini ortadan kaldirirken uzun ve dogru dizi okumalari uretir Modern baslangicinda yuksek verimli genom dizilimi genomun kucuk tek sarmalli parcalara bolunmesini ve ardindan parcalarin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile amplifikasyonunu icerir Sanger yontemini benimseyen her DNA fragmani fluoresan olarak etiketlenmis bir dideoksi zincirini sonlandiran nukleotidin dahil edilmesiyle geri dondurulemez bir sekilde sonlandirilir boylece her biri uzunlugu bir baz ile farklilik gosteren ve terminal bazinda baza ozgu bir floresan etiket tasiyan bir DNA fragmanlari uretir Guclendirilmis baz merdivenleri daha sonra parcalarin sirali bir dizisini saglayan floresan etiketli ssDNA parcalarinin otomatik yerinde bitis cizgisi tespiti ile Kapiler Dizi Elektroforezi ile ayrilir Bu dizi okumalari daha sonra bilgisayar tam olarak birlestirildikten sonra tam genomik diziye benzeyen ust uste binen veya bitisik dizilemeler contigs olarak adlandirilir halinde birlestirilir Sanger yontemleri yaklasik 800bp lik okuma uzunluklarina ulasir tipik olarak zenginlestirilmemis DNA ile 500 600bp Sanger yontemlerinde daha uzun okuma uzunluklari diger dizileme yontemlerine gore ozellikle genomun tekrarlayan bolgelerinin dizilenmesi acisindan onemli avantajlar sergilemektedir Kisa okunan dizi verilerinin zorlugu ozellikle yeni genomlarin de novo dizilemesinde ve yuksek duzeyde yeniden duzenlenmis genom bolumlerinin tipik olarak kanser genomlarinda veya yapisal varyasyon sergileyen kromozom bolgelerinde gorulenlerin dizilemesinde bir sorundur Mikroakiskan dizileme teknolojilerinin uygulamalari DNA dizilemesinin diger yararli uygulamalari arasinda tek nukleotid polimorfizm saptama tek sarmalli konformasyon polimorfizm heterodubleks analizi ve kisa tandem tekrar analizi yer alir DNA parcalarinin boyut ve veya konformasyon farkliliklarina gore cozumlenmesi genomun bu ozelliklerinin incelenmesinde en kritik adimdir Cihaz tasarimi Siralama cipi 100 mm capinda uc cam gofret ve bir polidimetilsiloksan membrandan olusan dort katmanli bir yapiya sahiptir Reaksiyon odalari ve kapiler elektroforez kanallari termal olarak baglanmis en ustteki iki cam wafer hangi cihaz ogelerinin mikrofabrike oldugu arasinda oyulmustur Uc boyutlu kanal ara baglantilari ve mikrovalfler PDMS ve alt manifold cam yonga plakasi tarafindan olusturulur Cihaz her biri Sanger dizileme adimlarina karsilik gelen uc islevsel birimden olusur Termal dongu unitesi entegre direncli sicaklik dedektoru mikrovalfler ve bir yuzey isiticisi olan 250 nanolitre reaksiyon odasidir Reaktifin en ustteki tum cam katman ile alt cam PDMS katmani arasindaki hareketi 500 µm capli gecis delikleri araciligiyla gerceklesir Termal donguden sonra reaksiyon karisimi yakalama saflastirma bolmesinde saflastirmaya tabi tutulur ve ardindan kapiler elektroforez bolmesine enjekte edilir CE unitesi 65 mm genisligindeki donuslerle kompakt bir geri donus duzenine katlanan 30 cm lik bir kapilerden olusur Dizileme kimyasi Termal dongu Termal dongu reaksiyon odasinda boya sonlandirici sekanslama reaktifi sablon DNA ve primerler termal dongu odasina yuklenir ve 35 dongu boyunca termal dongu yapilir 95 C de 12 saniye ve 60 C de 55 saniye Aritma Yuklenen reaksiyon karisimi uzatma parcalari sablon DNA ve fazla dizileme reaktifi icerir yakalama cikisi ve giris delikleri arasina uygulanan 33 Volt cm lik bir elektrik alani araciligiyla 30 C de bir yakalama saflastirma bolmesinden gecirilir Ornegin suruldugu yakalama jeli bir poliakrilamid matrisine kovalent olarak baglanmis 40 mM oligonukleotidden primerleri tamamlayici olusur Uzatma fragmanlari jel matris ile hareketsizlestirilir ve fazla primer sablon serbest nukleotitler ve tuzlar yakalama atik portu yoluyla elute edilir Yakalama jeli uzatma parcalarini serbest birakmak icin 67 75 C ye isitilir Kapiler elektroforez Uzatma fragmanlari 125 167 V cm alan araciligiyla elektroforeze tabi tutulduklari kapiler elektrofez bolmesine enjekte edilir Platformlar Apollo 100 platformu ilk iki Sanger siralama adimini termal dongu ve aritma tam otomatik bir sistemde birlestirir Uretici orneklerin ve reaktiflerin sisteme yuklenmesinin ardindan uc saat icinde kapiler elektroforez icin hazir oldugunu iddia ediyor Apollo 100 platformu mikrolitre alti reaktif hacmi gerektirir Diger dizileme teknikleriyle karsilastirmalar Sanger yontemleri ve gelecek nesil yontemler dahil olmak uzere genom dizileme teknolojileri icin performans degerleri Teknoloji Serit sayisi Enjeksiyon hacmi nL Analiz suresi Ortalama okuma uzunlugu Cikti analiz dahil Mb sa Jel dokulmesi Serit takibiDoseme jeli 96 500 1000 6 8 saat 700 bp 0 0672 Evet EvetKapiler dizi elektroforezi 96 1 5 1 3 saat 700 bp 0 166 Hayir HayirMikrocip 96 0 1 0 5 6 30 dakika 430 bp 0 660 Hayir Hayir454 Roche FLX 2008 lt 0 001 4 saat 200 300 bp 20 30Illumina Solexa 2008 2 3 gun 30 100 bp 20ABI SOLiD 2008 8 gun 35 bp 5 15Illumina MiSeq 2019 1 3 gun 2x75 2x300 bp 170 250Illumina NovaSeq 2019 1 2 gun 2x50 2x150 bp 22 000 67 000Ion Torrent Ion 530 2019 2 5 4 saat 200 600 bp 110 920BGI MGISEQ T7 2019 1 gun 2x150 bp 250 000Pacific Biosciences SMRT 2019 10 20 saat 10 30 kb 1 300Oxford Nanopore MinIon 2019 3 gun 13 20 kb 700 Yuksek verimli dizilimin nihai amaci dusuk maliyetli ve uzun okuma uzunluklari elde etmede son derece verimli sistemler gelistirmektir Her bir elektroforetik ayirmanin daha uzun okuma uzunluklari de novo DNA dizilemesi ile iliskili maliyeti ve belirli bir artiklikta DNA bilesenlerini dizilemek icin gereken sablon sayisini onemli olcude azaltir Mikroakiskanlar daha hizli daha ucuz ve daha kolay dizi montajina izin verebilir Kaynakca Sanger F Coulson AR Mayis 1975 A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase J Mol Biol 94 3 441 8 doi 10 1016 0022 2836 75 90213 2 PMID 1100841 a b c Sanger F Nicklen S Coulson AR Aralik 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A 74 12 5463 7 Bibcode 1977PNAS 74 5463S doi 10 1073 pnas 74 12 5463 PMC 431765 2 PMID 271968 Adams Jill U 2008 Nature Education 19 Ekim 2008 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 24 Ekim 2019 Smith LM Sanders JZ Kaiser RJ Hughes Peter Dodd Chris Connell Charles R Heiner Cheryl Kent Stephen B H Hood Leroy E 1986 Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis Nature 321 6071 674 9 Bibcode 1986Natur 321 674S doi 10 1038 321674a0 PMID 3713851 Smith LM Fung S Hunkapiller MW Hunkapiller TJ Hood LE Nisan 1985 The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5 terminus synthesis of fluorescent DNA primers for use in DNA sequence analysis Nucleic Acids Res 13 7 2399 412 doi 10 1093 nar 13 7 2399 PMC 341163 2 PMID 4000959 15 Aralik 2001 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 24 Subat 2011 Ledergerber C Dessimoz C 2011 Base calling for next generation sequencing platforms Briefings in Bioinformatics 12 5 489 97 doi 10 1093 bib bbq077 PMC 3178052 2 PMID 21245079 Murphy K Berg K Eshleman J 2005 Sequencing of genomic DNA by combined amplification and cycle sequencing reaction Clinical Chemistry 51 1 35 39 doi 10 1373 clinchem 2004 039164 PMID 15514094 Sengupta D Cookson B 2010 SeqSharp A general approach for improving cycle sequencing that facilitates a robust one step combined amplification and sequencing method The Journal of Molecular Diagnostics 12 3 272 277 doi 10 2353 jmoldx 2010 090134 PMC 2860461 2 PMID 20203000 a b c Kan Cheuk Wai Fredlake Christopher P Doherty Erin A S Barron Annelise E 1 Kasim 2004 DNA sequencing and genotyping in miniaturized electrophoresis systems Electrophoresis 25 21 22 3564 3588 doi 10 1002 elps 200406161 PMID 15565709 a b Morozova Olena Marra Marco A 2008 Applications of next generation sequencing technologies in functional genomics Genomics 92 5 255 64 doi 10 1016 j ygeno 2008 07 001 PMID 18703132 Microchip Biologies Inc Apollo 100 28 Agustos 2008 tarihinde Wayback Machine sitesinde Sinville Rondedrick Soper Steven A 2007 High resolution DNA separations using microchip electrophoresis Journal of Separation Science 30 11 1714 28 doi 10 1002 jssc 200700150 PMID 17623451 Kumar Kishore Cowley Mark Davis Ryan 2019 Next Generation Sequencing and Emerging Technologies Seminars in Thrombosis and Hemostasis 45 7 661 673 doi 10 1055 s 0039 1688446 ISSN 0094 6176 PMID 31096307 Tyson 2018 MinION based long read sequencing and assembly extends the Caenorhabditis elegans reference genome Genome Research 28 2 266 274 doi 10 1101 gr 221184 117 ISSN 1088 9051 PMC 5793790 2 PMID 29273626