Enzim ölçümleri enzim aktivitesini ölçmek için laboratuvar yöntemleridir. Enzim kinetiğini ve enzim inhibisyonunun araştırılması için önemlidirler.
Enzim birimleri
Enzim miktarları, diğer kimyasal bileşikler gibi, molar birim ile ifade edilebilir veya aktivite cinsinden enzim birimi ile ölçülebilir.
Enzim aktivitesi
Enzim aktivitesi, birim zaman başına dönüştürülen substrat mol sayısına eşittir, bir diğer deyişle reaksiyon hızı çarpı reaksiyon hacmine eşittir. Enzim aktivitesi mevcut aktif enzim miktarının bir ölçüsüdür ve dolayısıyla belirtilmesi gereken şartları bağlıdır. SI birimi katal'dır, 1 katal = 1 mol s−1 (1 mol/saniye)'dir ama bu aşırı büyük bir birimdir. Daha pratik ve yaygın kullanılan bir birim 1 enzim birimi = (U) = 1 μmol min−1. 1 U, 16.67 nanokatal'a eşittir.
Katal olarak verilen enzim aktivitesi genelde enzimin doğal hedefi varsayılarak ifade edilir. Enzim aktivitesi bazı standart substratlar cinsinden de verilebilir. Örneğin, jelatin için jelatin sindirim birimleri (İngilizce gelatin digesting units veya GDU) veya süt proteinleri için süt pıhtılaştırma birimleri (İng. milk clotting units yani MCU) kullanılır. Bu birimler bir gram enzimin jelatin veya süt proteinleini ne hızla sindireceğini ifade eder. Bir GDU yaklaşık 1,5 MCU'ya eşittir.
Spesifik aktivite
Bir enzimin spesifik aktivitesi yaygın kullanılan bir diğer birimdir. Bu, bir enzimin, 1 miligram toplam proteindeki aktivitesidir ve μmol dk−1mg−1 (mikromol bölü dakika bölü miligram) olarak ifade edilir. Spesifik aktivite enzim aktivitesinin bir ölçüsüdür. Toplam proteinin miligramı başına, belli bir süre zarfında ve belli şartlarda bir enzim tarafından meydana getirilen ürün miktarıdır. Spesifik aktivite reaksiyon hızı çarpı reaksiyon hacmi bölü toplam protein kütlesine eşittir. SI birimi katal kg−1'dir ama daha pratik bir birim μmol mg−1 dk−1'dir. Spesifik aktivite enzim ilerleyiciliğinin bir ölçüsüdür, belli bir substrat konsantrasyonunda (genelde enzimi doyurucu bir konsantrasyon kullanılır) ve saf enzim için genelde sabit bir değerdir. Enzimin saflaştırmasındaki veya diğer faktörlerdeki toplu iş (İng. batch) farklılıklarından kaynaklanan hataları bertaraf etmek için bir aktif bölge titrasyonu yapılması gerekir. Aktif bölge miktarını titre etmek için tersinmez bir enzim inhibitörü kullanılır, böylece aktif enzim miktarı ölçülür. Bu durumda, spesifik aktivite μmol min−1 mg−1 aktif enzim olarak ifade edilmelidir.
İlgili terminoloji
Reaksiyon hızı, birim zaman başına yok olan substrat (veya meydana gelen ürün) konsantrasyonudur (mol ).
% saflık, %100 × (enzim numunesinin spesifik aktvitesi / saf enzimin spesifik aktivitesi)'dir. Saf olmayan numunenin daha düşük bir spesifik aktivitesi olur çünkü kütlenin bir kısmı enzimden oluşmamaktadır. %100 saf enzimin spesifik aktivitesi biliniyorsa, saf olmayan bir numunenin spesifik aktivitesi daha düşük olacaktır, bu sayede saflık derecesi hesaplanabilir.
Ölçüm tipleri
Tüm enzim ölçümleri zamana bağlı olarak ya substrat tüketimini veya ürün üretimini ölçer. Substrat ve ürün konsantrasyonlarını ölçmek için çok sayıda farklı yöntem mevcuttur ve çoğu enzim birden çok yöntemle ölçülebilir. Biyokimyacılar genelde enzim tarafından katalizlenen reaksiyonları dört tip deney yoluyla çalışır:
- İlk hız deneyleri. Bir enzim aşırı miktarda bir substrat ile karıştırılınca, geçici bir dönem boyunca enzim-substrat araürünü hızla birikir. Ardından, reaksiyon sabıt durum kinetiğine ulaşır, enzim-substrat araürün konsantrasyonu zaman içinde yaklaşık sabit kalır ve reaksiyon hızı nispeten yavaş değişir. Sabit duruma ulaşıldıktan kısa bir süre sonra reaksiyon hızı ölçülmeye başlanır, genelde zamana bağlı olarak ürünün birikmesi takip edilir. Ölçümler kısa bir süre için yapıldığı ve aşırı konsantrasyonda substrat kullanıldığı için, serbest substrat konsantrasyonun ilk substrat konsantrasyonuna yaklaşık eşit olduğu varsayımı yapılabilir. İlk hız deneyleri yapılması ve analizi en kolay ölçümlerdir, çünkü ters reaksiyon ve enzim yıkımı gibi komplikasyonlardan yoksundur. Bu yüzden enzim kinetik deneylerinde kullanılan en yaygın deneylerden biridir.
- İlerleme eğrisi deneyleri. Bu deneylerde, kinetik parametrelerin belirlenmesi için, zamana bağlı substrat ve ürün konsantrasyonlarını ifade eden denklemler kullanılır. İlk hızlı dönemin ardından, reaksiyonun dengeye ulaşmasına izin verecek kadar uzun bir süre için, substrat veya ürün konsantrasyonu zamana bağlı olarak kaydedilir. Günümüzde artık pek kullanılmamakla beraber, enzim kinetiği tarihinin ilk dönemlerinde ilerleme eğrisi deneyleri yaygın olarak kullanılırdı.
- Geçici kinetik deneyleri. Bu deneylerde, ilk hızlı dönem sırasında reaksiyon takip edilir, enzim-substrat araürünü sabit-durum kinetiği dönemine ulaşana kadar. Bu deneyler yukarıda belirtilen diğer iki yöntemden daha zordur çünkü hızlı karıştırma ve gözlemleme yöntemleri gerektirirler.
- Relaksasyon deneyleri. Bu deneylerde bir enzim substrat ve ürün karışımına bir perturbasyon uygulanır, örneğin sıcaklık, basınç veya pH'de ani bir değişiklik yapılarak ve denge geri dönüş izlenir. Bu deneylerin analizi için tamamen tersinir reaksiyonun gözününe alınması gerekir. Üstelik, relaksasyon deneyleri mekanistik ayrıntıları nispeten duyarsızdır ve dolayıyla genelde mekanizmanın belirlenmesi için kullanılmaz.
Enzim ölçümleri örnekleme yöntmeleine göre iki gruba ayrılabilir: sürekli ölçümler'de aktivite sürekli olarak kaydedilir, süreksiz ölçümler'de ise düzenli zaman aralıklarında numuneler alınır, reaksiyon durudurulur ve substrat veya ürünlerin konsantrasyonları belirlenir.
Sürekli ölçümler
Sürekli ölçümler kullanışlıdır, fazladan bir işleme gerek kalmadan bir ölçüm ile reaksiyon hızı elde edilir. Sürekli ölçümlerin pek çok tipi vardır.
Spektrofotometrik
ölçümlerde, reaksiyonun gidişini izlemek için reaksiyon solüsyonunun ne kadar ışık soğurduğuna bakılır. Eğer ışık görünür bölgede ise, reaksiyonun renginde bir değişiklik görülebilir, bunlara kolorimetrik ölçüm denir. Bir tetrazolyum boyasının substrat olarak kullanıldığı , kolorimetrik ölçüme örnektir.
Mor ötesi sıkça kullanılır çünkü NADH ve NADPH gibi çoğu koenzim, indirgenmiş hâllerinde mor ötesini soğurur ama yükseltgenmiş (okside) biçimlerinde soğurmaz. NADH'yi substrat olarak kullanan bir oksidoredüktaz'in aktivitesini ölçmek için 340 nm dalgaboyundaki mor ötesi soğurmasındaki azalmayı takip edilebilir.
Doğrudan ve kenetli ölçümlerin kıyaslaması
Enzim reaksiyonu ışık soğurmasında bir değişikliğe neden olmasa da, kenetli ölçüm (İng. coupled assay) kullanılarak enzim için spektrofotometrik bir ölçüm yapılabilir. Burada, bir reaksiyonun ürünü, kolayca izlenebilen başka bir reaksiyonun substratıdır. Örneğin, sağdaki şekilde heksokinaz enzimi için bir kenetli ölçüm gösterilmiştir. Bu enzimin ürettiği glukoz-6-fosfat, aracılığıya, NADPH üretimine bağlanır.
Florometrik
Floresans, bir molekülün belli bir dalga boyunda ışık soğurduktan sonra başka bir dalga boyunda ışık salmasıdır. Florometrik enzim ölçümlerinde substrat floresansı ile ürün floresansı arasındaki farktan yararlanılır. Bu ölçümler spektrofotometrik ölçümlerden daha duyarlıdır ama bir dezavantajları, kaynaklanan enterferans ve çoğu floresan bileşiğin ışığa maruz kalınca bozulmalarıdır.
Bu ölçümlerin bir örneği, gnee nükleotit koenzimler NADH ve NADPH'nin kullanımıdır. Bu durumda, indirgenmiş (redüklenmiş) biçimler floresandır, yükseltgenmiş (okside) biçimler ise floresan değildir. Dolayısıyla, oksidasyon reaksiyonları floresans azalması ile, redüksiyon reaksiyonları da floreans artması ile izlenebilir. Enzim tarafından katalizlenen reaksiyonlarda floresan boya salan sentetik sbstratlar da mevcuttur, ölçümü için 4-metilumbelliferil-β-D-galactosit gibi.
Kalorimetrik
kimyasal reaksiyonlarda yayılan veya emilen ısının ölçümüdür. Çoğu reaksiyon bir ısı değişimine yol açtığı için bu yöntem çok genel amaçlıdır. Bir mikrokalorimetre kullanılırsa ölçüm için az miktarda enzim veya substrat yeterlidir. Başka yolla ölçülemeyen reaksiyonlar bu ölçüm yöntemi ile takip edilebilir.
Kemilüminesan
Kemilüminesans, bir kimyasal reaksiyon sonucu ışık salınmasıdır. Bazı enzim reaksiyonları ışık üretirler ve bu yolla ürün oluşumu ölçülebilir. Bu tip ölçümler çok duyarlı olabilir çünkü üretilen ışık fotoğraf filmi kullanılar günler veya haftalar boyunca yakalayabilir, ama nicelenmesi zor olabilir, çünkü salınan ışığın tamamı tespit edilmez.
Enzimatik kemilüminesans ile peroksidaz tespiti, Western blot ile antikorların tespiti için yaygın olarak kullanılır. Bir diğer örnek, ateş böceklerinden elde edilen lusiferaz enzimidir; bu enzim, substratı olan lusiferin ile reaksiyona girince ışık salar.
Işık saçılımı
çözeltideki makromoleküllerin ağırlıklı molar kütlesi ile konsantrasyonlarının çarpımını ölçer. Saçılım sinyali, ölçüm sırasında, bir veya birkaç kimyasalın belli bir sabit toplam konsantrasyonu için, çözeltideki tüm bileşiklerin molar kütlesinin ağırlıklı hesaplanmış doğrudan ölçümüdür. Kompleksler oluştukça veya ayrıştıkça bu değer değişir. Dolayıyla bu ölçüm ile komplekslerin stokyometresi ve kinetiği nicelenir. Protein kinetiğinin ışık saçılımı ile ölçümü, enzim gerektirmeyen çok genel bir yöntemdir.
Süreksiz ölçümler
Süreksiz ölçümlerde, bir enzim reaksiyonundan düzenli aralıklarla numuneler alınır ve bunlardaki ürün oluşumu veya substrat tüketimi ölçülür.
Radyometrik
Radyometrik ölçümler substratların için radyoaktivite dahil oluşu veya substrattan ayrılması ölçülür. Bu ölçümlerde en sık kullanılan radyoaktif izotoplar 14C, 32P, 35S ve 125I'dir. Radyoaktif izotoplar bir substratın tek bir atomunun spesifik işaretlenmesine izin verdiği için, bu ölçümler hem çok duyarlı hem de spesifiktir. Biyokimyada sıkça kullanılırlar ve kaba lizatlarda (yani bir hücre parçalandığı zaman elde edilen karmaşık enzim karışımlarında) spesifik bir reaksiyonun izlenmesinin çoğu zaman tek yoludur.
Bu yöntemlerde radyoaktivite genelde ile ölçülür.
Kromatografik
Kromotagrafik ölçümlerde, reaksiyon karışımı kromatografi yoluyla bileşenlerine ayrıştırılıp ve ürün miktarı belirlenir. Genelde bunun için kullanılır ama daha basit bir teknik olan de kullanılabilir. Bu yaklaşım için çok miktarda malzeme gerekse de, substrat veya ürünler radyoaktif veya floresan etketle işaretlenerek duyarlılık artırılabilir. Daha yüksek basınçta çalışan kromatografi araçlarının kullanımıyla da ölçüm duyarlılığı artırılabilir (bakınız ).
Ölçümlerde kontrol edilecek faktörler
- Tuz konsantrasyonu: Çoğu enzim çok yüksek tuz konsatrasyonuna dayanamaz. Iyonlar, proteindeki zayıf etki eder. Tipik enzimler 1-500 mM tuz konsantrasyonları arasında çalışır. Tabii ki, halofilik (tuz seven) yosun ve bakterilerin enzimleri gibi istisnalar mevcuttur.
- Sıcaklık Etkileri: Tüm enzimler ait oldukları organizmaya has sıcaklık aralığında çalışır. Sıcaklığın artırılması genelde reaksiyon hızında artışa yol açar. Ancak belli bir optimumun üstünde sıcaklığın yükselmesi reaksiyon hızını azaltır, çünkü enzim aktif bölgesinin üç boyutlu yapısını stabilize eden iyonik bağlar ve hidrojen bağları kopmaya başlar. İnsan enzimlerinde optimum sıcaklık genelde 35 ila 40 °C'dır. İnsan enzimleri 40 °C'ın üstünde hızla denatüre olmaya başlar. Sıcak su kaynaklarında (kaynarcalarda?) bulunan termofilik arkekerin enzimleri 100 °C'ye kadar stabildir. Ancal, bir enzim için "optimum" bir hız olduğu fikti yanıltıcıdır çünkü belli bir sıcaklıkta gözlemlenen hız aslında iki sıcaklığın çarpımıdır, reaksiyon hızı ve denatürasyon hızı. Eğer bir saniye için enzim aktvitesi ölçesiniz yüksek sıcaklıkta daha yüksek bir hız bulabilirsiniz ama ürün oluşumunu bir saat boyunca ölçseniz, yüksek sıcaklıkta daha az ürün oluştuğunu bulursunuz.
- pH etkileri: Çoğu enzim pH'ye duyarlıdır ve belli bir pH aralığında etkinlik gösterir. Hepsinin ptimum bir pH'si vardır. Aşırı pH değerlerinde iyonik bağlar ve hidrojen bağlarının kırılır, bunun sonucu enzimin üç boyutlu yapısı değişir (denatüre olur) ve enzim aktivitesi durur. Çoğu enzim pH 6 ilas 8'de çalışır; ancak, midede bulunan pepsin en iyi pH 2'de, tripsin ise en iyi pH 8'de çalışır.
- Substrat doyumu: Substrat konsantrasyonunu artırmak reaksiyon hızını (enzim aktivitesini) artırır. Ancak, enzimin doyumu reaksiyon hızını sınırlar. Tüm enzim moleküllerinin aktif bölgesi hemen hep dolu olduğu zaman enzimin doymuş olur. Doyum noktasına ulaşılınca artık ne kadar daha çok substrat eklenirse eklensin reaksiyon daha çok hızlanmaz. Reksiyon grafiği plato yapar.
- Kalabalıklık derecesi: Çözeltideki yüksek miktarda makromolekül olması, adı verilen bir etki ile, enzim reaksiyonlarının reaksiyon hızını ve denge sabitlerini etkiler.
Ayrıca bakınız
Kaynakça
- ^ Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) (1979). . Eur. J. Biochem. Cilt 97. ss. 319-20. doi:10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x. 21 Ocak 2019 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 3 Ağustos 2011.
- ^ How Many? A Dictionary of Units of Measurement 18 Şubat 2012 tarihinde Wayback Machine sitesinde . By Russ Rowlett at the University of North Carolina at Chapel Hill
- ^ Schnell, S., Chappell, M.J., Evans, N.D. Roussel, M.R. (2006). "The mechanism distinguishability problem in biochemical kinetics: The single-enzyme, single-substrate reaction as a case study". Comptes Rendus Biologies. 329 (1). ss. 51-61. doi:10.1016/j.crvi.2005.09.005. (PMID) 16399643.
- ^ Bergmeyer, H.U. (1974). Methods of Enzymatic Analysis. 4. New York: Academic Press. ss. 2066-72. ISBN .
- ^ Passonneau, J.V., Lowry, O.H. (1993). Enzymatic Analysis. A Practical Guide. Totowa NJ: Humana Press. ss. 85-110.
- ^ Todd MJ, Gomez J (Eylül 2001). "Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity?". Anal. Biochem. 296 (2). ss. 179-87. doi:10.1006/abio.2001.5218. (PMID) 11554713.
- ^ Churchwella, M; Twaddlea, N; Meekerb, L; Doergea, D. (Ekim 2005). "Improving Sensitivity in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry". Journal of Chromatography B. 825 (2). ss. 134-143.
- ^ Daniel RM, Peterson ME, Danson MJ; ve diğerleri. (Ocak 2010). "The molecular basis of the effect of temperature on enzyme activity". Biochem. J. 425 (2). ss. 353-60. doi:10.1042/BJ20091254. (PMID) 19849667.
- ^ Cowan DA (1997). "Thermophilic proteins: stability and function in aqueous and organic solvents". Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 118 (3). ss. 429-38. doi:10.1016/S0300-9629(97)00004-2. (PMID) 9406427.
- ^ Minton AP (2001). "The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media". J. Biol. Chem. 276 (14). ss. 10577-80. doi:10.1074/jbc.R100005200. (PMID) 11279227.
Dış bağlantılar
- OpenWetWare 12 Ocak 2012 tarihinde Wayback Machine sitesinde .
wikipedia, wiki, viki, vikipedia, oku, kitap, kütüphane, kütübhane, ara, ara bul, bul, herşey, ne arasanız burada,hikayeler, makale, kitaplar, öğren, wiki, bilgi, tarih, yukle, izle, telefon için, turk, türk, türkçe, turkce, nasıl yapılır, ne demek, nasıl, yapmak, yapılır, indir, ücretsiz, ücretsiz indir, bedava, bedava indir, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, resim, müzik, şarkı, film, film, oyun, oyunlar, mobil, cep telefonu, telefon, android, ios, apple, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, pc, web, computer, bilgisayar
Enzim olcumleri enzim aktivitesini olcmek icin laboratuvar yontemleridir Enzim kinetigini ve enzim inhibisyonunun arastirilmasi icin onemlidirler Beckman DU640 UV Vis spectrofotometresi Enzim birimleriEnzim miktarlari diger kimyasal bilesikler gibi molar birim ile ifade edilebilir veya aktivite cinsinden enzim birimi ile olculebilir Enzim aktivitesi Enzim aktivitesi birim zaman basina donusturulen substrat mol sayisina esittir bir diger deyisle reaksiyon hizi carpi reaksiyon hacmine esittir Enzim aktivitesi mevcut aktif enzim miktarinin bir olcusudur ve dolayisiyla belirtilmesi gereken sartlari baglidir SI birimi katal dir 1 katal 1 mol s 1 1 mol saniye dir ama bu asiri buyuk bir birimdir Daha pratik ve yaygin kullanilan bir birim 1 enzim birimi U 1 mmol min 1 1 U 16 67 nanokatal a esittir Katal olarak verilen enzim aktivitesi genelde enzimin dogal hedefi varsayilarak ifade edilir Enzim aktivitesi bazi standart substratlar cinsinden de verilebilir Ornegin jelatin icin jelatin sindirim birimleri Ingilizce gelatin digesting units veya GDU veya sut proteinleri icin sut pihtilastirma birimleri Ing milk clotting units yani MCU kullanilir Bu birimler bir gram enzimin jelatin veya sut proteinleini ne hizla sindirecegini ifade eder Bir GDU yaklasik 1 5 MCU ya esittir Spesifik aktivite Bir enzimin spesifik aktivitesi yaygin kullanilan bir diger birimdir Bu bir enzimin 1 miligram toplam proteindeki aktivitesidir ve mmol dk 1mg 1 mikromol bolu dakika bolu miligram olarak ifade edilir Spesifik aktivite enzim aktivitesinin bir olcusudur Toplam proteinin miligrami basina belli bir sure zarfinda ve belli sartlarda bir enzim tarafindan meydana getirilen urun miktaridir Spesifik aktivite reaksiyon hizi carpi reaksiyon hacmi bolu toplam protein kutlesine esittir SI birimi katal kg 1 dir ama daha pratik bir birim mmol mg 1 dk 1 dir Spesifik aktivite enzim ilerleyiciliginin bir olcusudur belli bir substrat konsantrasyonunda genelde enzimi doyurucu bir konsantrasyon kullanilir ve saf enzim icin genelde sabit bir degerdir Enzimin saflastirmasindaki veya diger faktorlerdeki toplu is Ing batch farkliliklarindan kaynaklanan hatalari bertaraf etmek icin bir aktif bolge titrasyonu yapilmasi gerekir Aktif bolge miktarini titre etmek icin tersinmez bir enzim inhibitoru kullanilir boylece aktif enzim miktari olculur Bu durumda spesifik aktivite mmol min 1 mg 1 aktif enzim olarak ifade edilmelidir Ilgili terminoloji Reaksiyon hizi birim zaman basina yok olan substrat veya meydana gelen urun konsantrasyonudur mol L 1s 1 displaystyle L 1 s 1 saflik 100 enzim numunesinin spesifik aktvitesi saf enzimin spesifik aktivitesi dir Saf olmayan numunenin daha dusuk bir spesifik aktivitesi olur cunku kutlenin bir kismi enzimden olusmamaktadir 100 saf enzimin spesifik aktivitesi biliniyorsa saf olmayan bir numunenin spesifik aktivitesi daha dusuk olacaktir bu sayede saflik derecesi hesaplanabilir Olcum tipleriTum enzim olcumleri zamana bagli olarak ya substrat tuketimini veya urun uretimini olcer Substrat ve urun konsantrasyonlarini olcmek icin cok sayida farkli yontem mevcuttur ve cogu enzim birden cok yontemle olculebilir Biyokimyacilar genelde enzim tarafindan katalizlenen reaksiyonlari dort tip deney yoluyla calisir Ilk hiz deneyleri Bir enzim asiri miktarda bir substrat ile karistirilinca gecici bir donem boyunca enzim substrat araurunu hizla birikir Ardindan reaksiyon sabit durum kinetigine ulasir enzim substrat araurun konsantrasyonu zaman icinde yaklasik sabit kalir ve reaksiyon hizi nispeten yavas degisir Sabit duruma ulasildiktan kisa bir sure sonra reaksiyon hizi olculmeye baslanir genelde zamana bagli olarak urunun birikmesi takip edilir Olcumler kisa bir sure icin yapildigi ve asiri konsantrasyonda substrat kullanildigi icin serbest substrat konsantrasyonun ilk substrat konsantrasyonuna yaklasik esit oldugu varsayimi yapilabilir Ilk hiz deneyleri yapilmasi ve analizi en kolay olcumlerdir cunku ters reaksiyon ve enzim yikimi gibi komplikasyonlardan yoksundur Bu yuzden enzim kinetik deneylerinde kullanilan en yaygin deneylerden biridir Ilerleme egrisi deneyleri Bu deneylerde kinetik parametrelerin belirlenmesi icin zamana bagli substrat ve urun konsantrasyonlarini ifade eden denklemler kullanilir Ilk hizli donemin ardindan reaksiyonun dengeye ulasmasina izin verecek kadar uzun bir sure icin substrat veya urun konsantrasyonu zamana bagli olarak kaydedilir Gunumuzde artik pek kullanilmamakla beraber enzim kinetigi tarihinin ilk donemlerinde ilerleme egrisi deneyleri yaygin olarak kullanilirdi Gecici kinetik deneyleri Bu deneylerde ilk hizli donem sirasinda reaksiyon takip edilir enzim substrat araurunu sabit durum kinetigi donemine ulasana kadar Bu deneyler yukarida belirtilen diger iki yontemden daha zordur cunku hizli karistirma ve gozlemleme yontemleri gerektirirler Relaksasyon deneyleri Bu deneylerde bir enzim substrat ve urun karisimina bir perturbasyon uygulanir ornegin sicaklik basinc veya pH de ani bir degisiklik yapilarak ve denge geri donus izlenir Bu deneylerin analizi icin tamamen tersinir reaksiyonun gozunune alinmasi gerekir Ustelik relaksasyon deneyleri mekanistik ayrintilari nispeten duyarsizdir ve dolayiyla genelde mekanizmanin belirlenmesi icin kullanilmaz Enzim olcumleri ornekleme yontmeleine gore iki gruba ayrilabilir surekli olcumler de aktivite surekli olarak kaydedilir sureksiz olcumler de ise duzenli zaman araliklarinda numuneler alinir reaksiyon durudurulur ve substrat veya urunlerin konsantrasyonlari belirlenir Bir spektrofotometrenin sicaklik kontrollu kuvet haznesi Surekli olcumlerSurekli olcumler kullanislidir fazladan bir isleme gerek kalmadan bir olcum ile reaksiyon hizi elde edilir Surekli olcumlerin pek cok tipi vardir Spektrofotometrik olcumlerde reaksiyonun gidisini izlemek icin reaksiyon solusyonunun ne kadar isik sogurduguna bakilir Eger isik gorunur bolgede ise reaksiyonun renginde bir degisiklik gorulebilir bunlara kolorimetrik olcum denir Bir tetrazolyum boyasinin substrat olarak kullanildigi kolorimetrik olcume ornektir Mor otesi sikca kullanilir cunku NADH ve NADPH gibi cogu koenzim indirgenmis hallerinde mor otesini sogurur ama yukseltgenmis okside bicimlerinde sogurmaz NADH yi substrat olarak kullanan bir oksidoreduktaz in aktivitesini olcmek icin 340 nm dalgaboyundaki mor otesi sogurmasindaki azalmayi takip edilebilir Dogrudan ve kenetli olcumlerin kiyaslamasi kullanilarak yapilan enzimi Enzim reaksiyonu isik sogurmasinda bir degisiklige neden olmasa da kenetli olcum Ing coupled assay kullanilarak enzim icin spektrofotometrik bir olcum yapilabilir Burada bir reaksiyonun urunu kolayca izlenebilen baska bir reaksiyonun substratidir Ornegin sagdaki sekilde heksokinaz enzimi icin bir kenetli olcum gosterilmistir Bu enzimin urettigi glukoz 6 fosfat araciligiya NADPH uretimine baglanir Florometrik Floresans bir molekulun belli bir dalga boyunda isik sogurduktan sonra baska bir dalga boyunda isik salmasidir Florometrik enzim olcumlerinde substrat floresansi ile urun floresansi arasindaki farktan yararlanilir Bu olcumler spektrofotometrik olcumlerden daha duyarlidir ama bir dezavantajlari kaynaklanan enterferans ve cogu floresan bilesigin isiga maruz kalinca bozulmalaridir Bu olcumlerin bir ornegi gnee nukleotit koenzimler NADH ve NADPH nin kullanimidir Bu durumda indirgenmis reduklenmis bicimler floresandir yukseltgenmis okside bicimler ise floresan degildir Dolayisiyla oksidasyon reaksiyonlari floresans azalmasi ile reduksiyon reaksiyonlari da floreans artmasi ile izlenebilir Enzim tarafindan katalizlenen reaksiyonlarda floresan boya salan sentetik sbstratlar da mevcuttur olcumu icin 4 metilumbelliferil b D galactosit gibi Kalorimetrik Luminol un kemiluminesansi kimyasal reaksiyonlarda yayilan veya emilen isinin olcumudur Cogu reaksiyon bir isi degisimine yol actigi icin bu yontem cok genel amaclidir Bir mikrokalorimetre kullanilirsa olcum icin az miktarda enzim veya substrat yeterlidir Baska yolla olculemeyen reaksiyonlar bu olcum yontemi ile takip edilebilir Kemiluminesan Kemiluminesans bir kimyasal reaksiyon sonucu isik salinmasidir Bazi enzim reaksiyonlari isik uretirler ve bu yolla urun olusumu olculebilir Bu tip olcumler cok duyarli olabilir cunku uretilen isik fotograf filmi kullanilar gunler veya haftalar boyunca yakalayabilir ama nicelenmesi zor olabilir cunku salinan isigin tamami tespit edilmez Enzimatik kemiluminesans ile peroksidaz tespiti Western blot ile antikorlarin tespiti icin yaygin olarak kullanilir Bir diger ornek ates boceklerinden elde edilen lusiferaz enzimidir bu enzim substrati olan lusiferin ile reaksiyona girince isik salar Isik sacilimi cozeltideki makromolekullerin agirlikli molar kutlesi ile konsantrasyonlarinin carpimini olcer Sacilim sinyali olcum sirasinda bir veya birkac kimyasalin belli bir sabit toplam konsantrasyonu icin cozeltideki tum bilesiklerin molar kutlesinin agirlikli hesaplanmis dogrudan olcumudur Kompleksler olustukca veya ayristikca bu deger degisir Dolayiyla bu olcum ile komplekslerin stokyometresi ve kinetigi nicelenir Protein kinetiginin isik sacilimi ile olcumu enzim gerektirmeyen cok genel bir yontemdir Sureksiz olcumlerSureksiz olcumlerde bir enzim reaksiyonundan duzenli araliklarla numuneler alinir ve bunlardaki urun olusumu veya substrat tuketimi olculur Radyometrik Radyometrik olcumler substratlarin icin radyoaktivite dahil olusu veya substrattan ayrilmasi olculur Bu olcumlerde en sik kullanilan radyoaktif izotoplar 14C 32P 35S ve 125I dir Radyoaktif izotoplar bir substratin tek bir atomunun spesifik isaretlenmesine izin verdigi icin bu olcumler hem cok duyarli hem de spesifiktir Biyokimyada sikca kullanilirlar ve kaba lizatlarda yani bir hucre parcalandigi zaman elde edilen karmasik enzim karisimlarinda spesifik bir reaksiyonun izlenmesinin cogu zaman tek yoludur Bu yontemlerde radyoaktivite genelde ile olculur Kromatografik Kromotagrafik olcumlerde reaksiyon karisimi kromatografi yoluyla bilesenlerine ayristirilip ve urun miktari belirlenir Genelde bunun icin kullanilir ama daha basit bir teknik olan de kullanilabilir Bu yaklasim icin cok miktarda malzeme gerekse de substrat veya urunler radyoaktif veya floresan etketle isaretlenerek duyarlilik artirilabilir Daha yuksek basincta calisan kromatografi araclarinin kullanimiyla da olcum duyarliligi artirilabilir bakiniz Olcumlerde kontrol edilecek faktorlerTuz konsantrasyonu Cogu enzim cok yuksek tuz konsatrasyonuna dayanamaz Iyonlar proteindeki zayif etki eder Tipik enzimler 1 500 mM tuz konsantrasyonlari arasinda calisir Tabii ki halofilik tuz seven yosun ve bakterilerin enzimleri gibi istisnalar mevcuttur Sicaklik Etkileri Tum enzimler ait olduklari organizmaya has sicaklik araliginda calisir Sicakligin artirilmasi genelde reaksiyon hizinda artisa yol acar Ancak belli bir optimumun ustunde sicakligin yukselmesi reaksiyon hizini azaltir cunku enzim aktif bolgesinin uc boyutlu yapisini stabilize eden iyonik baglar ve hidrojen baglari kopmaya baslar Insan enzimlerinde optimum sicaklik genelde 35 ila 40 C dir Insan enzimleri 40 C in ustunde hizla denature olmaya baslar Sicak su kaynaklarinda kaynarcalarda bulunan termofilik arkekerin enzimleri 100 C ye kadar stabildir Ancal bir enzim icin optimum bir hiz oldugu fikti yanilticidir cunku belli bir sicaklikta gozlemlenen hiz aslinda iki sicakligin carpimidir reaksiyon hizi ve denaturasyon hizi Eger bir saniye icin enzim aktvitesi olcesiniz yuksek sicaklikta daha yuksek bir hiz bulabilirsiniz ama urun olusumunu bir saat boyunca olcseniz yuksek sicaklikta daha az urun olustugunu bulursunuz pH etkileri Cogu enzim pH ye duyarlidir ve belli bir pH araliginda etkinlik gosterir Hepsinin ptimum bir pH si vardir Asiri pH degerlerinde iyonik baglar ve hidrojen baglarinin kirilir bunun sonucu enzimin uc boyutlu yapisi degisir denature olur ve enzim aktivitesi durur Cogu enzim pH 6 ilas 8 de calisir ancak midede bulunan pepsin en iyi pH 2 de tripsin ise en iyi pH 8 de calisir Substrat doyumu Substrat konsantrasyonunu artirmak reaksiyon hizini enzim aktivitesini artirir Ancak enzimin doyumu reaksiyon hizini sinirlar Tum enzim molekullerinin aktif bolgesi hemen hep dolu oldugu zaman enzimin doymus olur Doyum noktasina ulasilinca artik ne kadar daha cok substrat eklenirse eklensin reaksiyon daha cok hizlanmaz Reksiyon grafigi plato yapar Kalabaliklik derecesi Cozeltideki yuksek miktarda makromolekul olmasi adi verilen bir etki ile enzim reaksiyonlarinin reaksiyon hizini ve denge sabitlerini etkiler Ayrica bakinizEnzim kinetigiKaynakca Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry NC IUB 1979 Eur J Biochem Cilt 97 ss 319 20 doi 10 1111 j 1432 1033 1979 tb13116 x 21 Ocak 2019 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 3 Agustos 2011 How Many A Dictionary of Units of Measurement 18 Subat 2012 tarihinde Wayback Machine sitesinde By Russ Rowlett at the University of North Carolina at Chapel Hill Schnell S Chappell M J Evans N D Roussel M R 2006 The mechanism distinguishability problem in biochemical kinetics The single enzyme single substrate reaction as a case study Comptes Rendus Biologies 329 1 ss 51 61 doi 10 1016 j crvi 2005 09 005 PMID 16399643 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Bergmeyer H U 1974 Methods of Enzymatic Analysis 4 New York Academic Press ss 2066 72 ISBN 089573236X Passonneau J V Lowry O H 1993 Enzymatic Analysis A Practical Guide Totowa NJ Humana Press ss 85 110 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Todd MJ Gomez J Eylul 2001 Enzyme kinetics determined using calorimetry a general assay for enzyme activity Anal Biochem 296 2 ss 179 87 doi 10 1006 abio 2001 5218 PMID 11554713 Churchwella M Twaddlea N Meekerb L Doergea D Ekim 2005 Improving Sensitivity in Liquid Chromatography Mass Spectrometry Journal of Chromatography B 825 2 ss 134 143 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Daniel RM Peterson ME Danson MJ ve digerleri Ocak 2010 The molecular basis of the effect of temperature on enzyme activity Biochem J 425 2 ss 353 60 doi 10 1042 BJ20091254 PMID 19849667 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Cowan DA 1997 Thermophilic proteins stability and function in aqueous and organic solvents Comp Biochem Physiol A Physiol 118 3 ss 429 38 doi 10 1016 S0300 9629 97 00004 2 PMID 9406427 Minton AP 2001 The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media J Biol Chem 276 14 ss 10577 80 doi 10 1074 jbc R100005200 PMID 11279227 Dis baglantilarOpenWetWare 12 Ocak 2012 tarihinde Wayback Machine sitesinde