Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Western blot (diğer adı protein immünoblot) immünogenetik, moleküler biyoloji ve diğer moleküler biyoloji dallarında bir doku homojenatı veya ekstraktı numunesi içerisinde spesifik proteinlerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan bir analitik teknik.
Hedef proteinle etkileşmesi amacı ile sentetik veya hayvan kökenli antikorlar oluşturulur. Numune proteinleri denature edilir ve jel elektroforez uygulanır. Ardından, elektroforez membranı spesifik antikorlar içeren çözeltide yıkanır. Hedef proteine bağlanamamış antikorlaradan kurtulmak için ikinci yıkama işlemi gerçekleştirillir ve takiben birincil antikorlar etkileşecek olan ikincil antikorlar solusyona eklenir. Boyama, immünofloresan ve radyoaktivite gibi çeşitli metotlar ile ikincil antikor proteinleri görselleştirebilir.
Uygulama
Western blot yaygın olarak kullanıldığı biyokimyada amaç tek bir proteinin ve protein modifikasyonunun (post translasyonel modifikasyon gibi) kalitatif analizini gerçekleştirmektir. Genel kullanımı bir karışımda bir tek proteinin varlığının veya yokluğunun anlaşılması üzerinedir. Sonuçta görülen protein bandının renk yoğunluğu ve ölçüye göre yarı kantatif yorum yapılabilir. Western blot rutin olarak klonlama işleminin aradından klonlamanın başarı olup olmadığını onaylamak için kullanılır. HIV testinde veya BSE-Testinde medikal teşhis koyma için de kullanımı mevcuttur.
Prosedür
Western blot metodu jel elektroforezi, elektroforezde denature olmuş proteinlerin bir membran (genelde PVDF veya Nitroselluloz) üzerine elektroforetik aktarımını ve takiben görselleştirme amaçlı immünoboyama adımını içerir. Boyama işlemi blot membranı üzerinde yapılır. SDS-PAGE' te SDS kullanımı sebebi ile bütün proteinler negatif yüklenir ve yük faktörü hemen hemen ortadan kalkar. SDS-PAGE' in ardından proteinler bir membrana aktarılır. Yağsız süt yardımı ile membranın üstü süt proteinleri ile kaplanır. Yüzeyin kapanması ile birincil antikorların membran ile bağ kurması engellenirken aynı zamanda süt proteinlerine de bağlanma gerçekleşmez. Yani antikorların sadece hedef moleküllerine bağlanması sağlanır. Bu işleme bloklanma denir. Bloklanan faktör membrandır. Son olarak ikincil antikorlar eklenir. İkincil antikorun birincillere bağlanması ile boyanma gerçekleşir. Boyanma renk veya floresan ışık olarak gözlenebilir ve çeşitli araçlarla belirlenebilir.
Doku hazırlanışı
Numuneler bütün dokudan veya hücre kültüründen elde edilebilir. Katı dokular, blender homojenize edici veya yüksek ses ile, önce mekanik olarak parçalanır. Western blot sadece hücrelerle çalışmakla kısıtlı değildir, farzı misal, virüsler ve viral proteinler.
Hücre çözülmesini sağlamak ve proteinleri çözünür hale getirmek amacı ile çeşitli deterjanlar, tuzlar ve tampon çözeltiler kullanılabilir. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri hücrenin kendi enzimleri tarafından gene hücrenin kendi proteinlerini engellemek amacı ile sıkça kullanılır. Protein denaturasyonu ve parçalanmasından kaçınmak için numune soğukta hazırlanır.
Jel elektroforez
Proteinlerin ayrımında kullanılan jel elektroforez izoelektrik noktasını (pI), moleküler ağırlığı, elektrik yükünü veya bu faktörlerin bir kombinasyonunu temel alarak çalışır.
Aktarım
Proteinleri antikor ile bağlanmaya açık hale getirmek amaçlı proteinler nitrosellüloz veya PVDF' den yapılma membrana aktarılır. Jelden membrana doğru akım verilerek proteinlerin hareketinin sağlanmasına elektroblotlama denir. Geçiş sırasında proteinlerin jeldeki sırası ve organizasyonları korunur. Daha ilkel olan havlu metodu ise kapiler etkiden faydalanarak geçiş işlemini gerçekleştirir. Fkata havlu metodu çok zaman gerektirir. Nitroselluloz membranlar PVDF' den daha ucuz olmasına karşın çok daha kırılgan ve tekrar kullanıma uygun değildir.
Boyama ve tanımlama
Aktarımından ardından Total protein boyama adımı ile görselleştirme ve onun ardından bu görselliğin yoğunluğunun tespiti vardır.
Ayrıca bakınız
- Far-eastern blot
- Far-western blot
- Eastern blot
- Northwestern blot
- SDS-PAGE
- Fast paralel proteoliziz (FASTpp)
- Kuantitatif nokta blot
Kaynakça
- ^ a b Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9). ss. 4350-54. Bibcode:1979PNAS...76.4350T. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. (PMC) 411572 $2. (PMID) 388439.
- ^ Renart J, Reiser J, Stark GR (1979). "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure". Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (7). ss. 3116-20. Bibcode:1979PNAS...76.3116R. doi:10.1073/pnas.76.7.3116. (PMC) 383774 $2. (PMID) 91164.
- ^ Welinder, Charlotte; Ekblad, Lars (4 Mart 2011). "Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis". Journal of Proteome Research. 10 (3). ss. 1416-1419. doi:10.1021/pr1011476. ISSN 1535-3893.
Kaynak hatası: <references> üzerinde tanımlanan "Ambroz2006" adındaki <ref> etiketi önceki metinde kullanılmıyor. (Bkz: )
Kaynak hatası: <references> üzerinde tanımlanan "Burnette1981" adındaki <ref> etiketi önceki metinde kullanılmıyor. (Bkz: )
Kaynak hatası: <references> üzerinde tanımlanan "Stark1977" adındaki <ref> etiketi önceki metinde kullanılmıyor. (Bkz: )
<references> üzerinde tanımlanan "Reichel2016" adındaki <ref> etiketi önceki metinde kullanılmıyor. (Bkz: )Dış bağlantılar
wikipedia, wiki, viki, vikipedia, oku, kitap, kütüphane, kütübhane, ara, ara bul, bul, herşey, ne arasanız burada,hikayeler, makale, kitaplar, öğren, wiki, bilgi, tarih, yukle, izle, telefon için, turk, türk, türkçe, turkce, nasıl yapılır, ne demek, nasıl, yapmak, yapılır, indir, ücretsiz, ücretsiz indir, bedava, bedava indir, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, resim, müzik, şarkı, film, film, oyun, oyunlar, mobil, cep telefonu, telefon, android, ios, apple, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, pc, web, computer, bilgisayar
Western blot diger adi protein immunoblot immunogenetik molekuler biyoloji ve diger molekuler biyoloji dallarinda bir doku homojenati veya ekstrakti numunesi icerisinde spesifik proteinlerin tanimlanmasinda yaygin olarak kullanilan bir analitik teknik Western blot lipoik asit ile modifiye edilmis proteinleri taniyan bir antikor kullanimi ile gerceklesmis Western blot Hedef proteinle etkilesmesi amaci ile sentetik veya hayvan kokenli antikorlar olusturulur Numune proteinleri denature edilir ve jel elektroforez uygulanir Ardindan elektroforez membrani spesifik antikorlar iceren cozeltide yikanir Hedef proteine baglanamamis antikorlaradan kurtulmak icin ikinci yikama islemi gerceklestirillir ve takiben birincil antikorlar etkilesecek olan ikincil antikorlar solusyona eklenir Boyama immunofloresan ve radyoaktivite gibi cesitli metotlar ile ikincil antikor proteinleri gorsellestirebilir UygulamaWestern blot yaygin olarak kullanildigi biyokimyada amac tek bir proteinin ve protein modifikasyonunun post translasyonel modifikasyon gibi kalitatif analizini gerceklestirmektir Genel kullanimi bir karisimda bir tek proteinin varliginin veya yoklugunun anlasilmasi uzerinedir Sonucta gorulen protein bandinin renk yogunlugu ve olcuye gore yari kantatif yorum yapilabilir Western blot rutin olarak klonlama isleminin aradindan klonlamanin basari olup olmadigini onaylamak icin kullanilir HIV testinde veya BSE Testinde medikal teshis koyma icin de kullanimi mevcuttur ProsedurWestern blot metodu jel elektroforezi elektroforezde denature olmus proteinlerin bir membran genelde PVDF veya Nitroselluloz uzerine elektroforetik aktarimini ve takiben gorsellestirme amacli immunoboyama adimini icerir Boyama islemi blot membrani uzerinde yapilir SDS PAGE te SDS kullanimi sebebi ile butun proteinler negatif yuklenir ve yuk faktoru hemen hemen ortadan kalkar SDS PAGE in ardindan proteinler bir membrana aktarilir Yagsiz sut yardimi ile membranin ustu sut proteinleri ile kaplanir Yuzeyin kapanmasi ile birincil antikorlarin membran ile bag kurmasi engellenirken ayni zamanda sut proteinlerine de baglanma gerceklesmez Yani antikorlarin sadece hedef molekullerine baglanmasi saglanir Bu isleme bloklanma denir Bloklanan faktor membrandir Son olarak ikincil antikorlar eklenir Ikincil antikorun birincillere baglanmasi ile boyanma gerceklesir Boyanma renk veya floresan isik olarak gozlenebilir ve cesitli araclarla belirlenebilir Doku hazirlanisi Numuneler butun dokudan veya hucre kulturunden elde edilebilir Kati dokular blender homojenize edici veya yuksek ses ile once mekanik olarak parcalanir Western blot sadece hucrelerle calismakla kisitli degildir farzi misal virusler ve viral proteinler Hucre cozulmesini saglamak ve proteinleri cozunur hale getirmek amaci ile cesitli deterjanlar tuzlar ve tampon cozeltiler kullanilabilir Proteaz ve fosfataz inhibitorleri hucrenin kendi enzimleri tarafindan gene hucrenin kendi proteinlerini engellemek amaci ile sikca kullanilir Protein denaturasyonu ve parcalanmasindan kacinmak icin numune sogukta hazirlanir Jel elektroforez Proteinlerin ayriminda kullanilan jel elektroforez izoelektrik noktasini pI molekuler agirligi elektrik yukunu veya bu faktorlerin bir kombinasyonunu temel alarak calisir SDS PAGE elektroforezAktarim Proteinleri antikor ile baglanmaya acik hale getirmek amacli proteinler nitroselluloz veya PVDF den yapilma membrana aktarilir Jelden membrana dogru akim verilerek proteinlerin hareketinin saglanmasina elektroblotlama denir Gecis sirasinda proteinlerin jeldeki sirasi ve organizasyonlari korunur Daha ilkel olan havlu metodu ise kapiler etkiden faydalanarak gecis islemini gerceklestirir Fkata havlu metodu cok zaman gerektirir Nitroselluloz membranlar PVDF den daha ucuz olmasina karsin cok daha kirilgan ve tekrar kullanima uygun degildir Western blot transferBoyama ve tanimlama Aktarimindan ardindan Total protein boyama adimi ile gorsellestirme ve onun ardindan bu gorselligin yogunlugunun tespiti vardir Western blot baglanmasiRadyoaktif tanimlama sistemi ile western blotWestern blot kemiluminesant tanimlamaAyrica bakinizFar eastern blot Far western blot Eastern blot Northwestern blot SDS PAGE Fast paralel proteoliziz FASTpp Kuantitatif nokta blotKaynakca a b Towbin H Staehelin T Gordon J 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 9 ss 4350 54 Bibcode 1979PNAS 76 4350T doi 10 1073 pnas 76 9 4350 PMC 411572 2 PMID 388439 Renart J Reiser J Stark GR 1979 Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl paper and detection with antisera a method for studying antibody specificity and antigen structure Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 7 ss 3116 20 Bibcode 1979PNAS 76 3116R doi 10 1073 pnas 76 7 3116 PMC 383774 2 PMID 91164 Welinder Charlotte Ekblad Lars 4 Mart 2011 Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis Journal of Proteome Research 10 3 ss 1416 1419 doi 10 1021 pr1011476 ISSN 1535 3893 Kaynak hatasi lt references gt uzerinde tanimlanan Ambroz2006 adindaki lt ref gt etiketi onceki metinde kullanilmiyor Bkz Kaynak gosterme Kaynak hatasi lt references gt uzerinde tanimlanan Burnette1981 adindaki lt ref gt etiketi onceki metinde kullanilmiyor Bkz Kaynak gosterme Kaynak hatasi lt references gt uzerinde tanimlanan Stark1977 adindaki lt ref gt etiketi onceki metinde kullanilmiyor Bkz Kaynak gosterme Kaynak hatasi lt references gt uzerinde tanimlanan Reichel2016 adindaki lt ref gt etiketi onceki metinde kullanilmiyor Bkz Kaynak gosterme Dis baglantilarYang Ping Chang Mahmood Tahrin 2012 Western blot Technique theory and trouble shooting North American Journal of Medical Sciences 4 9 s 429 doi 10 4103 1947 2714 100998 ISSN 1947 2714 PMC 3456489 2 PMID 23050259