Bu maddenin içeriğinin Türkçeleştirilmesi veya doğrultusunda düzeltilmesi gerekmektedir. Bu maddedeki yazım ve noktalama yanlışları ya da anlatım bozuklukları giderilmelidir. (Yabancı sözcükler yerine Türkçe karşılıklarının kullanılması, karakter hatalarının düzeltilmesi, dilbilgisi hatalarının düzeltilmesi vs.) Düzenleme yapıldıktan sonra bu şablon kaldırılmalıdır. |
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC yaygın adıyla bilinir) bir analitik kimya yöntemidir. Karışımlardaki bileşenlerin, ayrıştırılmasında, nitelik ve niceliklerinin belirlenmesinde kullanılan bir analiz tekniğidir. Bu teknikte pompalar ile pompalanan yüksek basincli sıvı faz aracılığıyla taşınan analitler, kromatografik kolona ulaşır. Kolona ulaşan analitler, kolon ile farklı şekillerde etkileşip, farklı zamanlarda detektöre ulaşırlar. Burada, kolon katı bir adsorbent maddeyle doludur ki bu maddenin özellikleri sayesinde kromatografik ayrışma gerçekleşir.
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTgwTHpSaUwwRm5hV3hsYm5ReE1qQXdTRkJNUXk1cWNHY3ZNakl3Y0hndFFXZHBiR1Z1ZERFeU1EQklVRXhETG1wd1p3PT0uanBn.jpg)
HPLC üretim alanında (örneğin farmasötik ve biyolojik ürünlerin üretiminde), adli durumlarda (idrar tahlili vasıtasıyla performans artırıcı madde veya uyuşturucu bulgularında), araştırma alanında (örneğin kompleks biyolojik örneklerin ayrıştırılmasında veya sentetik kimyasalların ayrıştırılmasında) ve tıbbi alanda (örneğin kan serumundaki D vitamini tayininde) kullanılır.
Kromatografi, tanımına bakıldığında adsorpsiyon içeren bir kütle transfer prosesi olarak düşünülebilir. HPLC'de önceden bahsedildiği gibi, pompalarla numunelerin bir kolona gönderilip ayrıştırılması hususuna dayanır. Kromatografik kolonun aktif bileşeni (adsorbent) genellikle granüler yapıda olan, katı partiküllü (silicon veya polimerik yapıda olabilir) bir maddedir. Bu partiküller 2–50 μm boyutundadır. Kolona gelen karışımın bileşenleri bu partiküllerle olan farklı derecedeki kimyasal veya fiziksel etkilesimden dolayı birbirinden ayrılırlar. Bu karışımları taşıyan sıvılar genellikle yüksek basınç altındadırlar ve genelde birkaç solventin (çözgen) bileşiminden oluşurlar. Bu çözgenler genel olarak su, asetonitril, metanöldur. Analitleri taşıyan bu sıvıya sıvı faz denir. Sıvı fazın (veya likit faz) genel bileşimi (yani hangi solventlerden oluştuğu) ve sıcaklığı analitlerin ayrışma prosesinde önemli bir rol oynar. Bunun sebebi ise bu faktörlerin analit ve kolon (adsorbent) arasındaki etkileşimi direkt olarak etkilemesidir. Bu etkileşimler genellikle fiziksel etkileşimlerdir ve örnek vermek gerekirse hidrofobik (dispersif), dipol-dipol ve iyonik, genellikle bunların bileşimi şeklinde olabilir.
HPLC geleneksel (düşük basınçlı) sıvı kromatografisinden ayrılır. Bunun en önemli sebebi ise kullanılan basınç değerlerinin ciddi bir derecede fazla olmasıdır (50-350 bar). Geleneksel kromatografi genellikle yerçekimi gibi çok düşük basınç kullanırken, HPLC bahsedildiği gibi çok yüksek basınçlarda işlem yapar. HPLC'de ayrıştırılan madde miktarı çok düşük olduğu için, tipik kolon boyutları 2.1-4.6 mm çap, 20–250 mm uzunluğundadır. Ek olarak, HPLC kolonlarında kullanılan partiküllerin büyüklüğü genel olarak 2-50 μm arasındadır. Bu partikül boyutları HPLC'yi etkili ve popüler bir kimyasal ayrıştırma ya da analiz tekniği olmasını sağlar.
HPLC cihazları tipik olarak degasser, enjektör, pompa, kolon ve oluşur. Enjektörün örnek karışımını (numuneyi) mobil faza enjekte etmesiyle, analitler kolona taşınır. Kolon da içindeki sabit faz yardımıyla bu analitleri ayrıştırarak detektöre gönderir. Detektöre gelen analitler de miktarlarına ve hatta özelliklere göre sinyaller üretir. Bu sinyaller de mikroprosesörler ve veri analizi programlarıyla analizlenir. Bu veri analizi sayesinde kalitatif ve kantitatif analiz tamamlanmış olur. Modern kromatograflarda, pompalar değişik oranlardaki solventleri, zamana da bağlı olarak karıştırıp mobil fazlar üretebilir. Detektör olarak da genellikle UV/Vis detektörü, fotodiyot detektörü (PDA) veya kütle spektrometresi kullanılır. Çoğu HPLC cihazlarında, kolonun bulunduğu bir kolon bölümü (kolon fırını veya kolon kompartmanı da denir) bulunur ve bu bölüm kolon sıcaklığını değiştirerek, analitler ile kolonun içindeki sabit fazın etkileşimini etkiler. Bu etkileşim farklılaşması sayesinde analitlerin ayrışması sağlanır.
Çalışma Prensibi
Ayrışacak veya analizlenecek numune, cihaza çok küçük hacimlerde (tipik olarak mikrolitre seviyesinde) kromatograftaki mobil faz akışına verilir. Akan mobil faz, bu maddeleri kolona taşır. Numunenin içindeki analitler türlerine göre farklı hızlarda hareket ederler ve bu hız farkının belirlenmesinde sabit faz-analit etkileşimi (fiziksel etkileşimler) önemli bir rol oynar. Analitlerin taşınma hızı, analitlerin kimyasal doğasına, sabit fazın (kolon) kimyasal yapısına ve de mobil fazın bileşimine bağlıdır. Analitin kolondan çıkma süresine alıkonma zamanı (genelde RT ile gösterilir) denir. Alıkonma zamanı genelde analizdeki analitin karakterini belirlemede kullanılan önemli bir bilgidir.
Çok çeşitli HPLC kolonları piyasada mevcuttur. Bir HPLC kolonun niteliğini bir takım özellikleri belirler ve bu özelliklerden en önemlisi sabit fazının kimyasal yapısı, bir başka deyişle bu sabit fazı oluşturan partiküllerin türü ve büyüklüğüdür. HPLC kolonlarında partiküllerin boyutunun küçük olması kolondan gelen geri basıncı (ing. backpressure) artırır,. Kısacası partikül boyutunun düşmesi, geri basıncı da doğru orantılı olarak artırır. Tipik olarak, kolondaki küçük boyutlu partiküller, yüzey alanını artırdığından beraberinde analitlerin daha etkili bir biçimde ayrılışmasını (resolusyon) sağlar. Resolüsyon, kromatografide elde edilen ardışık analit piklerinin ayrışma derecesi olarak tanımlanabilir. Ek olarak, bu sorbent partikülleri hidrofobik veya polar olabilir.
Mobil fazlar incelendiğinde, genel olarak su ve suyla çözünebilen organik bir solvent kullanılır. Bu solventlerden de en yaygın olarak kullanılanları metanol ve asetonitrildir. Bazı HPLC teknikleri içinde suyun bulunnmadığı mobil fazlar da kullanılır (Normal faz sıvı kormatografisi). Genellikle mobil fazın içerisinde formik asit, fosforik asit veya trifloroasetik asit gibi veya bazı tuzlar da eklenir. Bu eklenen kimyasallar kromatografi operasyonuna, yani analitlerin ayrışmasına yardımcı olur. Mobil fazın bileşimi analiz sırasınca sabit tutulabilir ve bu işleme isokratik elüsyon denir. Mobil faz bileşiminin zamana bağlı değiştiği analizlere de gradyan elüsyon denir. İsokratik analizler genellikle kimyasal özellikleri tamamen farklı veya sabit faza farklı derecelerde ilgi gösteren molekülerin bulunduğu karışımları ayırmada kullanılır. Gradiyent analizlerde analitlerden elüsyon kuvveti az olandan çok olana doğru bir moleküler ayrışma gözlenir. Bir başka deyişle, analitler sabit faza yüksek afinite gösterdiklerinde, sabit fazla daha çok etkileşirler ve kolon içerisinde daha çok zaman geçirerek detektöre daha geç ulaşırlar, fakat bazı analitler de sabit fazla fazla etkileşmez ve daha hızlı bir biçimde detektöre ulaşırlar. Bu farklılık, farklı zamanlarda elde edilen sinyallere neden olur ve bu ilgili analitlerin kromatografik pikleri, kromatogramda farklı zamanlarda çıkar. Tipik bir ters faz kromatografi gradyan analizi %5 asetonitrile ile başlar ve doğrusal olarak 5-25 dakika içerisinde, %95'e kadar çıkar. Mobil fazın bileşimin değsımediği periyotlar da analiz profilinde yer alabilir. Örneğin, mobil faz 1-3 dakika boyunca %5 asetonitril seviyesinde kalabilir ve daha sonra doğrusal olarak ilerleyen dakikalarda %95'e çıkabilir.
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTlqTDJNNUwwWnlZV04wYVc5dVgwTnZiR3hsWTNSdmNsOVVkV0psWDFKaFkyc3VhbkJuTHpJeU1IQjRMVVp5WVdOMGFXOXVYME52Ykd4bFkzUnZjbDlVZFdKbFgxSmhZMnN1YW5Cbi5qcGc=.jpg)
Bu hususta, mobil fazın bileşiminin belirlenmesinde, mobil faz analit etkileşimi ve analit sabit faz (kolon) etkileşimleri göz önünde bulundurulur. Örneğin ters faz HPLC'de hidrofobik etkileşimler görülür. Analitlerin mobil faz ve sabit faza olan ilgisi (affinıtiesi) ve farklı analitlerin farklı derecelerde olan etkileşimleri sonucunda kromatografik ayrışma gerçekleşir. Bir başka deyişle, analitlerin sabit faz ve mobil fazdaki partisyonu kromatografik ayrışmada önemli rol oynar. Sıvı-sıvı ekstraksiyonunda da benzer prensip görülse de HPLC de bu işlem süreklidir, ekstraksiyonda ise adımlar şeklindedir. HPLC örneğinde, su/asetonitril mobil fazi kullanıldığında, hidrofobisitesi yüksek olan analitler kolondan daha geç ayrılacaklardır. Bunun sebebi ise, gradiyen bir metod kullanıldığı var sayıldığında, mobil fazdaki asetonitril miktarı zamanla artacaktır ve sonucunda da analitler kolonla daha çok etkileşeceklerdir. Mobil faz bileşenlerinin belirlenmesi, eklenmesi gereken tuz ve asitlerin seçilmesi, kolon seçimi, gradiyen zamanlarının belirlenmesi analizlerden önce dikkatle belirlenir ve bu aşamaya metod geliştirme denir.
Tarihsel Gelişimi
Bilim adamları, HPLC'den önce genel olarak standart sıvı kromatografisi tekniklerini kullanmaktaydı. Fakat sıvı kromatografisi, mobil fazın akış hızının yer çekimine bagli olmasından dolayı yeterince verimli değildi. Kimyasal ayrışmalar kimi zaman saatler hatta günler sürmekteydi. Gaz kromatografisi (GC) her ne kadar o günlerde sıvı kromatografisinden daha etkili olsa da, gaz fazındaki ayrışmaların ve yüksek molekül ağırlıklı polar molekullerin analizinin imkânsız olduğu düşünülmekteydi. GC biyokimyacılar için de yeterince etkili değildi ve bunun nedeni de, analizlenmek istenen moleküllerin termal kararlığa sahip olmamasıydı. Sonuç olarak, alternatif analiz yöntemleri ortaya sürüldü ve bu çalışmalar HPLC'nin gelişmesi ile sonuçlandı.
1941'de Martin ve Synge'in sıvı kromatografisi üzerine yaptığı çalışmalar genel olarak bu konudaki ilerleyen yıllardaki çalışmalara öncülük etmiştir. 60'li yıllarda Cal Giddings, Josef Huber ve diğer bilim adamları sıvı kromatografisinin, kolonlardaki partikül boyutunun küçülmesiyle çok daha etkili bir ve yüksek verimli bir biçimde çalışacağını öngördü. Burada bahsi geçen partiküller genel olarak 150 μm boyutundaydi ve bu partiküllerin küçülmesi ayni zamanda mobil fazın partiküller arasından akıp geçmesi için gerekli olan basıncı da kayda değer bir biçimde yükseltecekti. Bu tahminlere bağlı olarak, bilim adamları 60'li ve 70'li yillarin basinda bu konuları cok sayıda deneyler ile test edip bazı sonuçlara ulaştılar. Bunu sonucunda da, bahsi geçen büyük partiküllerin küçültülmesi amacıyla yeni partiküller geliştirilmeye başlandı. Zipax adında yapay olarak porlu partiküllerin HPLC kolon teknolijisi için gelecek vadeden bir buluş olduğu sonucuna varıldı.
1970'lerde HPLC donanımı ve enstrumentasyonu alanında birçok gelişme yaşandı. Araştırmacılar pompa ve enjektörler kullanarak ilk HPLC dizaynını tasarlayıp hayata geçirdiler. Gaz kullanarak yüksek basınca ulaşabilen pompalar kullanılan ilk pompalardandı. Bu tarz pompların ideal olmanın sebebi de sabit bir mobil faz akışı sağlayıp ve verimli derecede nicel analizde kullanılması için, sabit basınçta çalışabilmeleri, sızıntı yapmayan conta gereksinimine ihtiyaç duymaması gösterilebilir. Dupont (Endüstriyel Polimerler Bölümü) septumlu enjektör kısmını, sabit hacimli bir hazneye sahip bir enjeksiyon vanasıyla değiştirerek, daha verimli bir cihaz geliştirdi. Bu cihazda bekleme zamanı, yani hazırlanan mobil fazın kolona ulaşma zamanı (dwell) düşüktür ve bu nicel analizde önemli bir avantajdır.
Her ne kadar donanımsal gelişmeler çok önemli olsa da, HPLC'nin gelişimi genel olarak kolonlardaki kullanılan partiküllerin gelişimi ve evrimi etrafında şekillenmiştir. Bu konuda kolon, kimyasal ayrışmanın yer aldığı ünite olduğundan, bazen kromatografın kalbi olarak da bahsedilebilir. Sonuç olarak kolon da bir takım partiküllerden oluştuğu için, bu araştırmalar HPLC'nin gelişiminde çok önemli bir rol oynar. Porlu partiküllerin keşfinden sonra, bu partiküllerin boyutunu düşürmek için ciddi bir çaba harcanmış ve bu araştırmalar uzun süre devam etmiştir ve hatta günümüzde de devam etmektedir. Fakat, bu partikül boyutlarının küçülmesi yanında bir takım sorunları da getirmiştir. Bu sorunlardan birisi, mobil fazın basıncındaki oluşan dalgalanmalar, ani basınç düşmeleridir ki sabit basınç HPLC'de önemli bir parametre olarak gösterilir. Diğer bir problem de bu materyallerin kolona tekdüze ve homojen bir biçimde yerleştirilmesinin zor olmasıdır. Genellikle, ne zaman partikül boyutları ciddi bir bicimde düşürülse, buna uygun olan cihaz parçaları geliştirilir ve bunun en önemli sebebi de yüksek basınç gereksinimleridir.
HPLC Türleri
Partisyon kromatografisi
Partisyon kromatografisi, kimyagerlerin geliştirdiği ilk kromatografi türlerinden biriydi. Partisyon katsayısı prensibi, kağıt kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, gaz fazı ve sıvı-sıvı ayırma uygulamalarında uygulanmıştır. 1952 Nobel kimya ödülü amino asitleri ayırmak için kullanılan tekniği geliştirdikleri için Archer John Porter Martin ve Richard Laurence Millington Synge tarafından kazanıldı. Partisyon kromatografisinde, kağıt kromatografisinde olduğu gibi bir "inert" katı destekleyici matrisin yüzeyinde veya taneleri veya lifleri içinde tutulan bir çözücü kullanılır; veya sabit faz ile bazı kulombik ve / veya proton verici etkileşimlerinden yararlanır. Tıpkı hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC; HPLC içinde bir alt teknik) olduğu gibi, bu yöntem, analitleri polaritelerindeki farklılıklara göre ayırır. HILIC'de çoğunlukla güçlü bir bileşen olarak bağlı bir polar sabit faz ve genel olarak su ile asetonitrilden yapılmış bir mobil faz kullanır. Partisyon kromatografisi, geçmişte bağlı olmayan silika veya alümina desteklerde kullanılmıştır. HILIC, sabit fazları (kolonları), asidik, bazik ve nötr çözünenleri tek bir kromatografik çalışmada ayırma avantajına sahiptir.
Polar analitler, polar sabit faz ile ilişkili sabit bir su tabakasında dağılır ve böylece buraya tutunur. Polar analit ve polar sabit faz (mobil faza göre) arasındaki etkileşimler ne kadar güçlü olursa, elüsyon süresi de o kadar uzun olur. Etkileşim mukavemeti, daha fazla polarize olan grupla (örn., Hidroksil-) ve daha fazla tutunma sağlayan hidrojen bağlayabilen gruplarla, analit moleküler yapısının fonksiyonel gruplar kısmına bağlıdır. Kulombik (elektrostatik) etkileşimler de tutunmayı artırabilir. Mobil fazda daha fazla polar çözücünün kullanılması analitlerin alıkonma süresini azaltırken, daha hidrofobik çözücüler alıkoyma sürelerini artırma eğilimindedir.
Normal faz kromatografisi (NP-HPLC)
Normal faz kromatografisi, kimyagerlerin geliştirdiği ilk HPLC türlerinden biriydi. Normal fazlı HPLC (NP-HPLC) olarak da bilinen bu yöntem, analitleri, silika gibi bir polar sabit faza olan ilgilerine dayanarak ayırır, bu nedenle analitin polar etkileşimlere (hidrojen bağı veya dipol- dipol etkileşimler) ile sabit faz arasindaki etkileşim önemli bir rol oynar. NP-HPLC, apolar, sulu olmayan bir mobil faz (örn., Kloroform) kullanır ve apolar çözücülerde kolayca çözünür olan analitlerin ayrılması için de etkili bir yöntemdir. Analit, polar sabit faza tütünür aynı adsorbsiyon gözlenir. Adsorpsiyon kuvvetleri, artan analit polaritesi ile artar. Etkileşim gücü, sadece analit molekülünün yapısında bulunan fonksiyonel gruplara değil, aynı zamanda sterik etkiye de bağlıdır. Sterik engellemenin etkileşim gücü üzerindeki etkisi, bu yöntemin yapısal izomerleri ayırmasını sağlar.
Mobil fazda daha fazla polar çözücünün kullanılması, analitlerin tutulma süresini arttırır, oysa daha hidrofobik çözücüler daha hızlı elüsyon (daha düşük tutma süreleri) eğilimindedir. Hareketli fazdaki eser miktardaki su gibi çok polar çözücüler, sabit fazın katı yüzeyine adsorbe etme eğilimindedir, bu da tutmada aktif bir rol oynadığı düşünülen sabit (su) bir tabaka oluşturur. Bu davranış normal faz kromatografisine özgüdür denilebilir, çünkü neredeyse sadece tek bir adsorptif mekanizma tarafından yönetilir (yani analitler, sorbent yüzeyine bağlı bir ligandın solvatlanmış tabakası yerine katı bir yüzeyle etkileşime girer). Adsorpsiyon kromatografisi, aktif (kurutulmuş) silika veya alümina destekleri üzerinde hem kolon hem de ince tabaka kromatografi formatlarında yapısal izomer ayrımları için hala yaygın olarak kullanılmaktadır.
Silika veya alümina kromatografik sabit fazının (kolon) yüzeyinde su veya protik bir organik çözücü tabakasının varlığı nedeniyle ayrıca tutma sürelerinin tekrarlanabilirliğinin düşük olması sebebiyle, 1970'lerde NP-HPLC, ters fazlı HPLC'nin (RP-HPLC) gelişmesiyle gözden düşmüştür. Bu polar katman, hareketli fazın bileşimindeki herhangi bir değişiklikle (ör., Nem seviyesi) kolayca değişerek sürüklenme tutma sürelerine neden olur. Diğer bir çıkarım da, bu yöntemin tekraralanabilirlği bu sebepten dolayı bazi uygulamalarda düşebilir.
Son zamanlarda, partisyon kromatografisi, iyi tekrarlanabilirlik göstermesi, tekniğin kullanışlılığının daha iyi anlaşılması ve yeni HILIC sabit fazlarının geliştirilmesi ile yeniden popüler hale gelmiştir.
Yer değiştirme kromatografisi
Yer değiştirme kromatografisinin temel prensibi şöyledir: Kromatografi matrisi (yer değiştirici) için yüksek afiniteye sahip bir molekül, bağlanma bölgeleri için etkili bir şekilde rekabet eder ve böylece az afinite gosteren diger molekuller ile yer değiştirir. Yer değiştirme ve elüsyon kromatografisi arasında belirgin farklılıklar vardır. Elüsyon modunda, maddeler tipik olarak dar, Gaussian piki şeklinde kromatogramda gözlenir. Maksimum saflaştırma elde etmek için piklerin, tercihen taban çizgisinde geniş bir şekilde ayrılması arzu edilir. Bir karışımın herhangi bir bileşeninin elüsyon modunda kolondan aşağıya inme hızı birçok faktöre bağlıdır. Ancak iki maddenin farklı hızlarda hareket etmesi ve çözülmesi için, biyomoleküller ve kromatografi matrisi arasındaki bazı etkileşimlerde önemli farklılıklar olmalıdır. Tekniğin çalışma parametreleri, bu farkın etkisini en üst düzeye çıkarmak için ayarlanır. Birçok durumda, piklerin taban çizgisi (ing. baseline) ile ayrılması sadece gradiyen elüsyonu ve düşük kolon yüklemeleri ile gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, özellikle preparatif ölçekte elüsyon modu kromatografisinin iki dezavantajı vardır: Gradiyen çözücü pompalaması nedeniyle operasyonel karmaşıklık ve düşük kolon yüklemeleri nedeniyle düşük verimdir. Yer değiştirme kromatografisi, bileşenlerin “pikler” yerine ardışık saf madde bölgelerine ayrılması nedeniyle elüsyon kromatografisine göre avantajlara sahiptir. Bu işlem, izotermlerin doğrusal olmama özelliğinden yararlandığından, daha büyük bir kolon beslemesi, belirli bir kolon üzerinde, daha yüksek konsantrasyonda geri kazanılan saflaştırılmış bileşenler ile ayrılabilir.
Jel permeasyon kromatografisi
Boyut dışlama kromatografisi veya jel filtrasyon kromatografisi olarak da bilinen bu yöntem, parçacıkları moleküler boyut temelinde (parçacıklarin Stokes yarıçapıyla) ayırır. Genellikle düşük çözünürlüklü bir kromatografik yöntemdir ve bu nedenle genellikle saflaştırmanın son "cilalama" aşamasına ayrılır. Saflaştırılmış proteinlerin tersiyer yapısını ve kuaterner yapısını belirlemek için de yararlıdır. SEC öncelikle proteinler veya polimerler gibi büyük moleküllerin analizi için kullanılır. SEC, bu küçük molekülleri bir parçacığın gözeneklerinde yakalar. Daha büyük moleküller, gözeneklere girmek için çok büyük oldukları için gözeneklerden geçer. Bu nedenle daha büyük moleküller kolondan daha küçük moleküllere göre daha hızlı akarlar, yani molekül ne kadar küçük olursa tutma süresi de o kadar uzun olur.
Bu teknik, polisakkaritlerin moleküler ağırlık tayini için yaygın olarak kullanılmaktadır. SEC, piyasada bulunan farklı düşük molekül ağırlıklı heparinlerin moleküler ağırlık karşılaştırması için resmi tekniktir (Avrupa farmakopisi tarafından önerilmektedir).
İyon değiştirme kromatografisi
İyon değiştirme kromatografisinde (IC) alıkonma ya da retansiyon, çözünen iyonlar ve sabit faza bağlı yüklü bölgeler arasındaki çekim üzerine kuruludur. Kolondaki yüklü bölgelerle, aynı yükün çözünmüş iyonları etkileşim dışında bırakılırken, kolonun yüklü bölgelerinin ters yükünün çözünen iyonları kolon üzerinde tutulur. Kolon üzerinde tutulan çözünük iyonlar, çözücü koşullarının değiştirilmesi (örn., Çözeltinin tuz konsantrasyonunun arttırılması, kolon sıcaklığının arttırılması, çözücünün pH'ının değiştirilmesi) yoluyla çözücü sisteminin iyon etkisini arttırmak suretiyle kolondan elüte edilebilir
İyon değiştirici tipleri arasında polistiren reçineleri, selüloz ve dekstran iyon değiştiricileri (jeller) ve kontrollü gözenekli cam veya gözenekli silika bulunur. Polistiren reçineler zincirin stabilitesini artıran çapraz bağlanmaya izin verir. Daha fazla çapraz bağ içeren reçinelerde, denegelenme zamanını artiran ve sonuçta seçiciliği geliştiren dönmeyi azaltır. Selüloz ve dekstran bazlı iyon değiştiriciler, daha büyük gözenek boyutlarına ve düşük yük yoğunluklarına sahiptirler ve bu da proteinlerin ayrılması için uygundur.
Genel olarak iyon değiştiriciler, daha yüksek yük ve daha küçük yarıçaplı iyonların bağlanmasını destekler.
Karşı iyondaki (pozitif ya da negatif) bir artış (reçinelerdeki fonksiyonel gruplara göre) tutma süresini azaltır. pH değerindeki bir azalma katyon değişimindeki alıkonma süresini azaltırken pH'daki bir artış anyon değişimindeki alıkonma süresini azaltır. Bir katyon değiştirme kolonundaki çözücünün pH'ının düşürülmesi ile, örneğin, anyonik sabit fazdaki konumlar için rekabet edebilecek, böylece zayıf bağlanmış katyonları çıkaracak daha fazla hidrojen iyonu mevcuttur.
Bu kromatografi formu, şu uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır: su saflaştırma, eser bileşenlerin önceden konsantre edilmesi, ligand değişim kromatografisi, proteinlerin iyon değişim kromatografisi, karbohidratların ve oligosakkaritlerin yüksek pH anyon değişim kromatografisi vb.
Biyoafinite kromatografisi
Bu kromatografik işlem, kararlı, spesifik ve geri dönüşümlü kompleksler oluşturmak için biyolojik olarak aktif maddelerin özelliğine dayanır. Bu komplekslerin oluşumu, Van der Waals etkileşimi, elektrostatik etkileşim, dipol-dipol etkileşimi, hidrofobik etkileşim ve hidrojen bağı gibi ortak moleküler kuvvetlerin katılımını içerir. Etkin, biyospesifik bir bağ ve tamamlayıcı bağlanma bölgelerindeki bu kuvvetlerin birçoğunun eşzamanlı ve uyumlu bir eylemiyle oluşur.
İzokratik ve Gradyan Elüsyonu
Mobil faz kompozisyonunun prosedür boyunca sabit kaldığı bir ayırmaya izokratik (sabit kompozisyon) denir. Bu kelime, HPLC'nin öncülerinden biri olan Csaba Horvath tarafından ilk kez kullanıldı.
Mobil faz kompozisyonunu her zaman sabit kalmayabilir. Ayırma işlemi sırasında mobil faz kompozisyonunun değiştirildiği bir ayırma, gradyan elüsyon denir. Örneğin,% 10 metanolde başlayan ve 20 dakika sonra% 90 metanolde biten bir analize gradyan elusyon denilebilir. Hareketli fazın iki bileşeni tipik olarak "A" ve "B" olarak adlandırılır; A, çözünen maddenin sadece yavaş yavaş elüte olmasına izin veren "zayıf" çözücüdür ki genelde sudur, B ise çözünen maddeleri kolondan hızla elüte eden "güçlü" çözücüdür. Ters fazlı kromatografide (RP-HPLC) çözücü A genellikle su veya sulu bir tampondur, B ise asetonitril, metanol, THF veya izopropanol gibi suyla karışabilen organik bir solventtir.
İzokratik elüsyonda, piklerin tepe genişliği, teorik plakaların sayısı olan N denklemine göre doğrusal olarak tutma süresi ile (retensiyon zamani) artar. Bu, geç cikan piklerin çok düz ve geniş olması bir dezavantajdır.
HPLC'deki parametreler
Teorik Parametreler
HPLC'deki kromatografik ayrışmalar, bir UV detektörü veya bir kütle spektrometresi gibi bir cihaz ile tespit edildiğinde, bileşenlerin sinyal piklerine ayrılmasını tanımlamak için teorik parametreler ve denklemler kullanılır. Bu parametreler büyük ölçüde iki kromatografik teori setinden türetilir: plaka teorisi (Partisyon kromatografisinin bir parçası olarak) ve Van Deemter denklemi. Van Deemter denklemi daha doğru teori olarak kabul edilmesine rağmen, HPLC kromatogramlarının analizinde genelde ikisinden de yararlanılır.
HPLC'de ayrışma tıpkı kağıt kromatografisindeki ayrışan piklerle yapılan retensiyon faktörünün hesaplanmasına benzer. HPLC parametreleri şunlardır: verimlilik faktörü (N), retensiyon faktörü (kappa prime) ve ayırma faktörü (alfa). Faktörler birlikte, iki pikin tepe noktalarının birbirinden ne kadar iyi ayrıldığını veya örtüştüğünü açıklayan bir çözünürlük denklemindeki değişkenlerdir. Bu parametreler çoğunlukla sadece RP-HPLC ve NP-HPLC ayrımlarını tanımlamak için kullanılır, çünkü bu ayrımlar diğer HPLC türlerinden (ör. İyon değişimi ve jel permeasyon) daha küçük olma eğilimindedir.
Kaynakça
- ^ Morgan, David J. (19 Kasım 2003). "Fraksiyon toplayici (post on Flickr)". Flickr. 22 Şubat 2016 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 28 Ekim 2015.
İnglizce Vikipedi HPLC maddesinden çeviri (Son ulaşım 18 Nisan 2020) 14 Nisan 2020 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.
wikipedia, wiki, viki, vikipedia, oku, kitap, kütüphane, kütübhane, ara, ara bul, bul, herşey, ne arasanız burada,hikayeler, makale, kitaplar, öğren, wiki, bilgi, tarih, yukle, izle, telefon için, turk, türk, türkçe, turkce, nasıl yapılır, ne demek, nasıl, yapmak, yapılır, indir, ücretsiz, ücretsiz indir, bedava, bedava indir, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, resim, müzik, şarkı, film, film, oyun, oyunlar, mobil, cep telefonu, telefon, android, ios, apple, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, pc, web, computer, bilgisayar
Bu maddenin iceriginin Turkcelestirilmesi veya Turkce dilbilgisi ve kurallari dogrultusunda duzeltilmesi gerekmektedir Bu maddedeki yazim ve noktalama yanlislari ya da anlatim bozukluklari giderilmelidir Yabanci sozcukler yerine Turkce karsiliklarinin kullanilmasi karakter hatalarinin duzeltilmesi dilbilgisi hatalarinin duzeltilmesi vs Duzenleme yapildiktan sonra bu sablon kaldirilmalidir Yuksek performansli sivi kromatografisi HPLC yaygin adiyla bilinir bir analitik kimya yontemidir Karisimlardaki bilesenlerin ayristirilmasinda nitelik ve niceliklerinin belirlenmesinde kullanilan bir analiz teknigidir Bu teknikte pompalar ile pompalanan yuksek basincli sivi faz araciligiyla tasinan analitler kromatografik kolona ulasir Kolona ulasan analitler kolon ile farkli sekillerde etkilesip farkli zamanlarda detektore ulasirlar Burada kolon kati bir adsorbent maddeyle doludur ki bu maddenin ozellikleri sayesinde kromatografik ayrisma gerceklesir Modern HPLC cihazi HPLC uretim alaninda ornegin farmasotik ve biyolojik urunlerin uretiminde adli durumlarda idrar tahlili vasitasiyla performans artirici madde veya uyusturucu bulgularinda arastirma alaninda ornegin kompleks biyolojik orneklerin ayristirilmasinda veya sentetik kimyasallarin ayristirilmasinda ve tibbi alanda ornegin kan serumundaki D vitamini tayininde kullanilir Kromatografi tanimina bakildiginda adsorpsiyon iceren bir kutle transfer prosesi olarak dusunulebilir HPLC de onceden bahsedildigi gibi pompalarla numunelerin bir kolona gonderilip ayristirilmasi hususuna dayanir Kromatografik kolonun aktif bileseni adsorbent genellikle granuler yapida olan kati partikullu silicon veya polimerik yapida olabilir bir maddedir Bu partikuller 2 50 mm boyutundadir Kolona gelen karisimin bilesenleri bu partikullerle olan farkli derecedeki kimyasal veya fiziksel etkilesimden dolayi birbirinden ayrilirlar Bu karisimlari tasiyan sivilar genellikle yuksek basinc altindadirlar ve genelde birkac solventin cozgen bilesiminden olusurlar Bu cozgenler genel olarak su asetonitril metanoldur Analitleri tasiyan bu siviya sivi faz denir Sivi fazin veya likit faz genel bilesimi yani hangi solventlerden olustugu ve sicakligi analitlerin ayrisma prosesinde onemli bir rol oynar Bunun sebebi ise bu faktorlerin analit ve kolon adsorbent arasindaki etkilesimi direkt olarak etkilemesidir Bu etkilesimler genellikle fiziksel etkilesimlerdir ve ornek vermek gerekirse hidrofobik dispersif dipol dipol ve iyonik genellikle bunlarin bilesimi seklinde olabilir HPLC geleneksel dusuk basincli sivi kromatografisinden ayrilir Bunun en onemli sebebi ise kullanilan basinc degerlerinin ciddi bir derecede fazla olmasidir 50 350 bar Geleneksel kromatografi genellikle yercekimi gibi cok dusuk basinc kullanirken HPLC bahsedildigi gibi cok yuksek basinclarda islem yapar HPLC de ayristirilan madde miktari cok dusuk oldugu icin tipik kolon boyutlari 2 1 4 6 mm cap 20 250 mm uzunlugundadir Ek olarak HPLC kolonlarinda kullanilan partikullerin buyuklugu genel olarak 2 50 mm arasindadir Bu partikul boyutlari HPLC yi etkili ve populer bir kimyasal ayristirma ya da analiz teknigi olmasini saglar HPLC cihazlari tipik olarak degasser enjektor pompa kolon ve olusur Enjektorun ornek karisimini numuneyi mobil faza enjekte etmesiyle analitler kolona tasinir Kolon da icindeki sabit faz yardimiyla bu analitleri ayristirarak detektore gonderir Detektore gelen analitler de miktarlarina ve hatta ozelliklere gore sinyaller uretir Bu sinyaller de mikroprosesorler ve veri analizi programlariyla analizlenir Bu veri analizi sayesinde kalitatif ve kantitatif analiz tamamlanmis olur Modern kromatograflarda pompalar degisik oranlardaki solventleri zamana da bagli olarak karistirip mobil fazlar uretebilir Detektor olarak da genellikle UV Vis detektoru fotodiyot detektoru PDA veya kutle spektrometresi kullanilir Cogu HPLC cihazlarinda kolonun bulundugu bir kolon bolumu kolon firini veya kolon kompartmani da denir bulunur ve bu bolum kolon sicakligini degistirerek analitler ile kolonun icindeki sabit fazin etkilesimini etkiler Bu etkilesim farklilasmasi sayesinde analitlerin ayrismasi saglanir Calisma PrensibiAyrisacak veya analizlenecek numune cihaza cok kucuk hacimlerde tipik olarak mikrolitre seviyesinde kromatograftaki mobil faz akisina verilir Akan mobil faz bu maddeleri kolona tasir Numunenin icindeki analitler turlerine gore farkli hizlarda hareket ederler ve bu hiz farkinin belirlenmesinde sabit faz analit etkilesimi fiziksel etkilesimler onemli bir rol oynar Analitlerin tasinma hizi analitlerin kimyasal dogasina sabit fazin kolon kimyasal yapisina ve de mobil fazin bilesimine baglidir Analitin kolondan cikma suresine alikonma zamani genelde RT ile gosterilir denir Alikonma zamani genelde analizdeki analitin karakterini belirlemede kullanilan onemli bir bilgidir Cok cesitli HPLC kolonlari piyasada mevcuttur Bir HPLC kolonun niteligini bir takim ozellikleri belirler ve bu ozelliklerden en onemlisi sabit fazinin kimyasal yapisi bir baska deyisle bu sabit fazi olusturan partikullerin turu ve buyuklugudur HPLC kolonlarinda partikullerin boyutunun kucuk olmasi kolondan gelen geri basinci ing backpressure artirir Kisacasi partikul boyutunun dusmesi geri basinci da dogru orantili olarak artirir Tipik olarak kolondaki kucuk boyutlu partikuller yuzey alanini artirdigindan beraberinde analitlerin daha etkili bir bicimde ayrilismasini resolusyon saglar Resolusyon kromatografide elde edilen ardisik analit piklerinin ayrisma derecesi olarak tanimlanabilir Ek olarak bu sorbent partikulleri hidrofobik veya polar olabilir Mobil fazlar incelendiginde genel olarak su ve suyla cozunebilen organik bir solvent kullanilir Bu solventlerden de en yaygin olarak kullanilanlari metanol ve asetonitrildir Bazi HPLC teknikleri icinde suyun bulunnmadigi mobil fazlar da kullanilir Normal faz sivi kormatografisi Genellikle mobil fazin icerisinde formik asit fosforik asit veya trifloroasetik asit gibi veya bazi tuzlar da eklenir Bu eklenen kimyasallar kromatografi operasyonuna yani analitlerin ayrismasina yardimci olur Mobil fazin bilesimi analiz sirasinca sabit tutulabilir ve bu isleme isokratik elusyon denir Mobil faz bilesiminin zamana bagli degistigi analizlere de gradyan elusyon denir Isokratik analizler genellikle kimyasal ozellikleri tamamen farkli veya sabit faza farkli derecelerde ilgi gosteren molekulerin bulundugu karisimlari ayirmada kullanilir Gradiyent analizlerde analitlerden elusyon kuvveti az olandan cok olana dogru bir molekuler ayrisma gozlenir Bir baska deyisle analitler sabit faza yuksek afinite gosterdiklerinde sabit fazla daha cok etkilesirler ve kolon icerisinde daha cok zaman gecirerek detektore daha gec ulasirlar fakat bazi analitler de sabit fazla fazla etkilesmez ve daha hizli bir bicimde detektore ulasirlar Bu farklilik farkli zamanlarda elde edilen sinyallere neden olur ve bu ilgili analitlerin kromatografik pikleri kromatogramda farkli zamanlarda cikar Tipik bir ters faz kromatografi gradyan analizi 5 asetonitrile ile baslar ve dogrusal olarak 5 25 dakika icerisinde 95 e kadar cikar Mobil fazin bilesimin degsimedigi periyotlar da analiz profilinde yer alabilir Ornegin mobil faz 1 3 dakika boyunca 5 asetonitril seviyesinde kalabilir ve daha sonra dogrusal olarak ilerleyen dakikalarda 95 e cikabilir HPLC sisteminden cikan maddelerin toplandigi bir duzenek Bu hususta mobil fazin bilesiminin belirlenmesinde mobil faz analit etkilesimi ve analit sabit faz kolon etkilesimleri goz onunde bulundurulur Ornegin ters faz HPLC de hidrofobik etkilesimler gorulur Analitlerin mobil faz ve sabit faza olan ilgisi affinitiesi ve farkli analitlerin farkli derecelerde olan etkilesimleri sonucunda kromatografik ayrisma gerceklesir Bir baska deyisle analitlerin sabit faz ve mobil fazdaki partisyonu kromatografik ayrismada onemli rol oynar Sivi sivi ekstraksiyonunda da benzer prensip gorulse de HPLC de bu islem sureklidir ekstraksiyonda ise adimlar seklindedir HPLC orneginde su asetonitril mobil fazi kullanildiginda hidrofobisitesi yuksek olan analitler kolondan daha gec ayrilacaklardir Bunun sebebi ise gradiyen bir metod kullanildigi var sayildiginda mobil fazdaki asetonitril miktari zamanla artacaktir ve sonucunda da analitler kolonla daha cok etkileseceklerdir Mobil faz bilesenlerinin belirlenmesi eklenmesi gereken tuz ve asitlerin secilmesi kolon secimi gradiyen zamanlarinin belirlenmesi analizlerden once dikkatle belirlenir ve bu asamaya metod gelistirme denir Tarihsel GelisimiBilim adamlari HPLC den once genel olarak standart sivi kromatografisi tekniklerini kullanmaktaydi Fakat sivi kromatografisi mobil fazin akis hizinin yer cekimine bagli olmasindan dolayi yeterince verimli degildi Kimyasal ayrismalar kimi zaman saatler hatta gunler surmekteydi Gaz kromatografisi GC her ne kadar o gunlerde sivi kromatografisinden daha etkili olsa da gaz fazindaki ayrismalarin ve yuksek molekul agirlikli polar molekullerin analizinin imkansiz oldugu dusunulmekteydi GC biyokimyacilar icin de yeterince etkili degildi ve bunun nedeni de analizlenmek istenen molekullerin termal kararliga sahip olmamasiydi Sonuc olarak alternatif analiz yontemleri ortaya suruldu ve bu calismalar HPLC nin gelismesi ile sonuclandi 1941 de Martin ve Synge in sivi kromatografisi uzerine yaptigi calismalar genel olarak bu konudaki ilerleyen yillardaki calismalara onculuk etmistir 60 li yillarda Cal Giddings Josef Huber ve diger bilim adamlari sivi kromatografisinin kolonlardaki partikul boyutunun kuculmesiyle cok daha etkili bir ve yuksek verimli bir bicimde calisacagini ongordu Burada bahsi gecen partikuller genel olarak 150 mm boyutundaydi ve bu partikullerin kuculmesi ayni zamanda mobil fazin partikuller arasindan akip gecmesi icin gerekli olan basinci da kayda deger bir bicimde yukseltecekti Bu tahminlere bagli olarak bilim adamlari 60 li ve 70 li yillarin basinda bu konulari cok sayida deneyler ile test edip bazi sonuclara ulastilar Bunu sonucunda da bahsi gecen buyuk partikullerin kucultulmesi amaciyla yeni partikuller gelistirilmeye baslandi Zipax adinda yapay olarak porlu partikullerin HPLC kolon teknolijisi icin gelecek vadeden bir bulus oldugu sonucuna varildi 1970 lerde HPLC donanimi ve enstrumentasyonu alaninda bircok gelisme yasandi Arastirmacilar pompa ve enjektorler kullanarak ilk HPLC dizaynini tasarlayip hayata gecirdiler Gaz kullanarak yuksek basinca ulasabilen pompalar kullanilan ilk pompalardandi Bu tarz pomplarin ideal olmanin sebebi de sabit bir mobil faz akisi saglayip ve verimli derecede nicel analizde kullanilmasi icin sabit basincta calisabilmeleri sizinti yapmayan conta gereksinimine ihtiyac duymamasi gosterilebilir Dupont Endustriyel Polimerler Bolumu septumlu enjektor kismini sabit hacimli bir hazneye sahip bir enjeksiyon vanasiyla degistirerek daha verimli bir cihaz gelistirdi Bu cihazda bekleme zamani yani hazirlanan mobil fazin kolona ulasma zamani dwell dusuktur ve bu nicel analizde onemli bir avantajdir Her ne kadar donanimsal gelismeler cok onemli olsa da HPLC nin gelisimi genel olarak kolonlardaki kullanilan partikullerin gelisimi ve evrimi etrafinda sekillenmistir Bu konuda kolon kimyasal ayrismanin yer aldigi unite oldugundan bazen kromatografin kalbi olarak da bahsedilebilir Sonuc olarak kolon da bir takim partikullerden olustugu icin bu arastirmalar HPLC nin gelisiminde cok onemli bir rol oynar Porlu partikullerin kesfinden sonra bu partikullerin boyutunu dusurmek icin ciddi bir caba harcanmis ve bu arastirmalar uzun sure devam etmistir ve hatta gunumuzde de devam etmektedir Fakat bu partikul boyutlarinin kuculmesi yaninda bir takim sorunlari da getirmistir Bu sorunlardan birisi mobil fazin basincindaki olusan dalgalanmalar ani basinc dusmeleridir ki sabit basinc HPLC de onemli bir parametre olarak gosterilir Diger bir problem de bu materyallerin kolona tekduze ve homojen bir bicimde yerlestirilmesinin zor olmasidir Genellikle ne zaman partikul boyutlari ciddi bir bicimde dusurulse buna uygun olan cihaz parcalari gelistirilir ve bunun en onemli sebebi de yuksek basinc gereksinimleridir HPLC TurleriPartisyon kromatografisi Partisyon kromatografisi kimyagerlerin gelistirdigi ilk kromatografi turlerinden biriydi Partisyon katsayisi prensibi kagit kromatografisi ince tabaka kromatografisi gaz fazi ve sivi sivi ayirma uygulamalarinda uygulanmistir 1952 Nobel kimya odulu amino asitleri ayirmak icin kullanilan teknigi gelistirdikleri icin Archer John Porter Martin ve Richard Laurence Millington Synge tarafindan kazanildi Partisyon kromatografisinde kagit kromatografisinde oldugu gibi bir inert kati destekleyici matrisin yuzeyinde veya taneleri veya lifleri icinde tutulan bir cozucu kullanilir veya sabit faz ile bazi kulombik ve veya proton verici etkilesimlerinden yararlanir Tipki hidrofilik etkilesim kromatografisinde HILIC HPLC icinde bir alt teknik oldugu gibi bu yontem analitleri polaritelerindeki farkliliklara gore ayirir HILIC de cogunlukla guclu bir bilesen olarak bagli bir polar sabit faz ve genel olarak su ile asetonitrilden yapilmis bir mobil faz kullanir Partisyon kromatografisi gecmiste bagli olmayan silika veya alumina desteklerde kullanilmistir HILIC sabit fazlari kolonlari asidik bazik ve notr cozunenleri tek bir kromatografik calismada ayirma avantajina sahiptir Polar analitler polar sabit faz ile iliskili sabit bir su tabakasinda dagilir ve boylece buraya tutunur Polar analit ve polar sabit faz mobil faza gore arasindaki etkilesimler ne kadar guclu olursa elusyon suresi de o kadar uzun olur Etkilesim mukavemeti daha fazla polarize olan grupla orn Hidroksil ve daha fazla tutunma saglayan hidrojen baglayabilen gruplarla analit molekuler yapisinin fonksiyonel gruplar kismina baglidir Kulombik elektrostatik etkilesimler de tutunmayi artirabilir Mobil fazda daha fazla polar cozucunun kullanilmasi analitlerin alikonma suresini azaltirken daha hidrofobik cozuculer alikoyma surelerini artirma egilimindedir Normal faz kromatografisi NP HPLC Normal faz kromatografisi kimyagerlerin gelistirdigi ilk HPLC turlerinden biriydi Normal fazli HPLC NP HPLC olarak da bilinen bu yontem analitleri silika gibi bir polar sabit faza olan ilgilerine dayanarak ayirir bu nedenle analitin polar etkilesimlere hidrojen bagi veya dipol dipol etkilesimler ile sabit faz arasindaki etkilesim onemli bir rol oynar NP HPLC apolar sulu olmayan bir mobil faz orn Kloroform kullanir ve apolar cozuculerde kolayca cozunur olan analitlerin ayrilmasi icin de etkili bir yontemdir Analit polar sabit faza tutunur ayni adsorbsiyon gozlenir Adsorpsiyon kuvvetleri artan analit polaritesi ile artar Etkilesim gucu sadece analit molekulunun yapisinda bulunan fonksiyonel gruplara degil ayni zamanda sterik etkiye de baglidir Sterik engellemenin etkilesim gucu uzerindeki etkisi bu yontemin yapisal izomerleri ayirmasini saglar Mobil fazda daha fazla polar cozucunun kullanilmasi analitlerin tutulma suresini arttirir oysa daha hidrofobik cozuculer daha hizli elusyon daha dusuk tutma sureleri egilimindedir Hareketli fazdaki eser miktardaki su gibi cok polar cozuculer sabit fazin kati yuzeyine adsorbe etme egilimindedir bu da tutmada aktif bir rol oynadigi dusunulen sabit su bir tabaka olusturur Bu davranis normal faz kromatografisine ozgudur denilebilir cunku neredeyse sadece tek bir adsorptif mekanizma tarafindan yonetilir yani analitler sorbent yuzeyine bagli bir ligandin solvatlanmis tabakasi yerine kati bir yuzeyle etkilesime girer Adsorpsiyon kromatografisi aktif kurutulmus silika veya alumina destekleri uzerinde hem kolon hem de ince tabaka kromatografi formatlarinda yapisal izomer ayrimlari icin hala yaygin olarak kullanilmaktadir Silika veya alumina kromatografik sabit fazinin kolon yuzeyinde su veya protik bir organik cozucu tabakasinin varligi nedeniyle ayrica tutma surelerinin tekrarlanabilirliginin dusuk olmasi sebebiyle 1970 lerde NP HPLC ters fazli HPLC nin RP HPLC gelismesiyle gozden dusmustur Bu polar katman hareketli fazin bilesimindeki herhangi bir degisiklikle or Nem seviyesi kolayca degiserek suruklenme tutma surelerine neden olur Diger bir cikarim da bu yontemin tekraralanabilirlgi bu sebepten dolayi bazi uygulamalarda dusebilir Son zamanlarda partisyon kromatografisi iyi tekrarlanabilirlik gostermesi teknigin kullanisliliginin daha iyi anlasilmasi ve yeni HILIC sabit fazlarinin gelistirilmesi ile yeniden populer hale gelmistir Yer degistirme kromatografisi Yer degistirme kromatografisinin temel prensibi soyledir Kromatografi matrisi yer degistirici icin yuksek afiniteye sahip bir molekul baglanma bolgeleri icin etkili bir sekilde rekabet eder ve boylece az afinite gosteren diger molekuller ile yer degistirir Yer degistirme ve elusyon kromatografisi arasinda belirgin farkliliklar vardir Elusyon modunda maddeler tipik olarak dar Gaussian piki seklinde kromatogramda gozlenir Maksimum saflastirma elde etmek icin piklerin tercihen taban cizgisinde genis bir sekilde ayrilmasi arzu edilir Bir karisimin herhangi bir bileseninin elusyon modunda kolondan asagiya inme hizi bircok faktore baglidir Ancak iki maddenin farkli hizlarda hareket etmesi ve cozulmesi icin biyomolekuller ve kromatografi matrisi arasindaki bazi etkilesimlerde onemli farkliliklar olmalidir Teknigin calisma parametreleri bu farkin etkisini en ust duzeye cikarmak icin ayarlanir Bircok durumda piklerin taban cizgisi ing baseline ile ayrilmasi sadece gradiyen elusyonu ve dusuk kolon yuklemeleri ile gerceklestirilebilir Bu nedenle ozellikle preparatif olcekte elusyon modu kromatografisinin iki dezavantaji vardir Gradiyen cozucu pompalamasi nedeniyle operasyonel karmasiklik ve dusuk kolon yuklemeleri nedeniyle dusuk verimdir Yer degistirme kromatografisi bilesenlerin pikler yerine ardisik saf madde bolgelerine ayrilmasi nedeniyle elusyon kromatografisine gore avantajlara sahiptir Bu islem izotermlerin dogrusal olmama ozelliginden yararlandigindan daha buyuk bir kolon beslemesi belirli bir kolon uzerinde daha yuksek konsantrasyonda geri kazanilan saflastirilmis bilesenler ile ayrilabilir Jel permeasyon kromatografisi Boyut dislama kromatografisi veya jel filtrasyon kromatografisi olarak da bilinen bu yontem parcaciklari molekuler boyut temelinde parcaciklarin Stokes yaricapiyla ayirir Genellikle dusuk cozunurluklu bir kromatografik yontemdir ve bu nedenle genellikle saflastirmanin son cilalama asamasina ayrilir Saflastirilmis proteinlerin tersiyer yapisini ve kuaterner yapisini belirlemek icin de yararlidir SEC oncelikle proteinler veya polimerler gibi buyuk molekullerin analizi icin kullanilir SEC bu kucuk molekulleri bir parcacigin gozeneklerinde yakalar Daha buyuk molekuller gozeneklere girmek icin cok buyuk olduklari icin gozeneklerden gecer Bu nedenle daha buyuk molekuller kolondan daha kucuk molekullere gore daha hizli akarlar yani molekul ne kadar kucuk olursa tutma suresi de o kadar uzun olur Bu teknik polisakkaritlerin molekuler agirlik tayini icin yaygin olarak kullanilmaktadir SEC piyasada bulunan farkli dusuk molekul agirlikli heparinlerin molekuler agirlik karsilastirmasi icin resmi tekniktir Avrupa farmakopisi tarafindan onerilmektedir Iyon degistirme kromatografisi Iyon degistirme kromatografisinde IC alikonma ya da retansiyon cozunen iyonlar ve sabit faza bagli yuklu bolgeler arasindaki cekim uzerine kuruludur Kolondaki yuklu bolgelerle ayni yukun cozunmus iyonlari etkilesim disinda birakilirken kolonun yuklu bolgelerinin ters yukunun cozunen iyonlari kolon uzerinde tutulur Kolon uzerinde tutulan cozunuk iyonlar cozucu kosullarinin degistirilmesi orn Cozeltinin tuz konsantrasyonunun arttirilmasi kolon sicakliginin arttirilmasi cozucunun pH inin degistirilmesi yoluyla cozucu sisteminin iyon etkisini arttirmak suretiyle kolondan elute edilebilir Iyon degistirici tipleri arasinda polistiren recineleri seluloz ve dekstran iyon degistiricileri jeller ve kontrollu gozenekli cam veya gozenekli silika bulunur Polistiren recineler zincirin stabilitesini artiran capraz baglanmaya izin verir Daha fazla capraz bag iceren recinelerde denegelenme zamanini artiran ve sonucta seciciligi gelistiren donmeyi azaltir Seluloz ve dekstran bazli iyon degistiriciler daha buyuk gozenek boyutlarina ve dusuk yuk yogunluklarina sahiptirler ve bu da proteinlerin ayrilmasi icin uygundur Genel olarak iyon degistiriciler daha yuksek yuk ve daha kucuk yaricapli iyonlarin baglanmasini destekler Karsi iyondaki pozitif ya da negatif bir artis recinelerdeki fonksiyonel gruplara gore tutma suresini azaltir pH degerindeki bir azalma katyon degisimindeki alikonma suresini azaltirken pH daki bir artis anyon degisimindeki alikonma suresini azaltir Bir katyon degistirme kolonundaki cozucunun pH inin dusurulmesi ile ornegin anyonik sabit fazdaki konumlar icin rekabet edebilecek boylece zayif baglanmis katyonlari cikaracak daha fazla hidrojen iyonu mevcuttur Bu kromatografi formu su uygulamalarda yaygin olarak kullanilmaktadir su saflastirma eser bilesenlerin onceden konsantre edilmesi ligand degisim kromatografisi proteinlerin iyon degisim kromatografisi karbohidratlarin ve oligosakkaritlerin yuksek pH anyon degisim kromatografisi vb Biyoafinite kromatografisi Bu kromatografik islem kararli spesifik ve geri donusumlu kompleksler olusturmak icin biyolojik olarak aktif maddelerin ozelligine dayanir Bu komplekslerin olusumu Van der Waals etkilesimi elektrostatik etkilesim dipol dipol etkilesimi hidrofobik etkilesim ve hidrojen bagi gibi ortak molekuler kuvvetlerin katilimini icerir Etkin biyospesifik bir bag ve tamamlayici baglanma bolgelerindeki bu kuvvetlerin bircogunun eszamanli ve uyumlu bir eylemiyle olusur Izokratik ve Gradyan ElusyonuMobil faz kompozisyonunun prosedur boyunca sabit kaldigi bir ayirmaya izokratik sabit kompozisyon denir Bu kelime HPLC nin onculerinden biri olan Csaba Horvath tarafindan ilk kez kullanildi Mobil faz kompozisyonunu her zaman sabit kalmayabilir Ayirma islemi sirasinda mobil faz kompozisyonunun degistirildigi bir ayirma gradyan elusyon denir Ornegin 10 metanolde baslayan ve 20 dakika sonra 90 metanolde biten bir analize gradyan elusyon denilebilir Hareketli fazin iki bileseni tipik olarak A ve B olarak adlandirilir A cozunen maddenin sadece yavas yavas elute olmasina izin veren zayif cozucudur ki genelde sudur B ise cozunen maddeleri kolondan hizla elute eden guclu cozucudur Ters fazli kromatografide RP HPLC cozucu A genellikle su veya sulu bir tampondur B ise asetonitril metanol THF veya izopropanol gibi suyla karisabilen organik bir solventtir Izokratik elusyonda piklerin tepe genisligi teorik plakalarin sayisi olan N denklemine gore dogrusal olarak tutma suresi ile retensiyon zamani artar Bu gec cikan piklerin cok duz ve genis olmasi bir dezavantajdir HPLC deki parametrelerTeorik Parametreler HPLC deki kromatografik ayrismalar bir UV detektoru veya bir kutle spektrometresi gibi bir cihaz ile tespit edildiginde bilesenlerin sinyal piklerine ayrilmasini tanimlamak icin teorik parametreler ve denklemler kullanilir Bu parametreler buyuk olcude iki kromatografik teori setinden turetilir plaka teorisi Partisyon kromatografisinin bir parcasi olarak ve Van Deemter denklemi Van Deemter denklemi daha dogru teori olarak kabul edilmesine ragmen HPLC kromatogramlarinin analizinde genelde ikisinden de yararlanilir HPLC de ayrisma tipki kagit kromatografisindeki ayrisan piklerle yapilan retensiyon faktorunun hesaplanmasina benzer HPLC parametreleri sunlardir verimlilik faktoru N retensiyon faktoru kappa prime ve ayirma faktoru alfa Faktorler birlikte iki pikin tepe noktalarinin birbirinden ne kadar iyi ayrildigini veya ortustugunu aciklayan bir cozunurluk denklemindeki degiskenlerdir Bu parametreler cogunlukla sadece RP HPLC ve NP HPLC ayrimlarini tanimlamak icin kullanilir cunku bu ayrimlar diger HPLC turlerinden or Iyon degisimi ve jel permeasyon daha kucuk olma egilimindedir Kaynakca Morgan David J 19 Kasim 2003 Fraksiyon toplayici post on Flickr Flickr 22 Subat 2016 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 28 Ekim 2015 Inglizce Vikipedi HPLC maddesinden ceviri Son ulasim 18 Nisan 2020 14 Nisan 2020 tarihinde Wayback Machine sitesinde arsivlendi