Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Karbonik Anhidraz ya da karbonik dehidrataz, aktif bölgesinde çinko (Zn2+) iyonu içeren bir ailesidir ve yavaş bir reaksiyon olan karbondioksitin bikarbonat ve protona dönüşümünü katalizler. Karbonik anhidraz bu reaksiyonun hızını ileri derecede artırarak saniyede 104 – 106 reaksiyon hızına ulaştırır. Kırmızı kan hücrelerinde, hayvanların diğer kısımlarında ve bitkilerde bulunan, karbonik asidi karbondioksit ve suyla parçalayan enzim.
| Karbonik anhidraz | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 | |||||||
| İnsan karbonik anhidrazı Şerit diyagramı II, merkezinde Çinko iyonu görülmektedir. | |||||||
| Tanımlayıcılar | |||||||
| EC numarası | 4.2.1.1 | ||||||
| CAS numarası | 9001-03-0 | ||||||
| Veritabanları | |||||||
| IntEnz view | |||||||
| BRENDA entry | |||||||
| NiceZyme view | |||||||
| KEGG | KEGG entry | ||||||
| metabolic pathway | |||||||
| profile | |||||||
| PDB structures | RCSB PDB PDBj PDBe PDBsum | ||||||
| AmiGO / EGO | |||||||
| |||||||
Ökaryotik tipi karbonik anhidraz | |
| Tanımlayıcılar | |
| Sembol | Carb_anhydrase |
| Diğer bilgiler | |
Reaksiyon
CO2 + H2O --> HCO3- + H+
CO2 Difüzyonla kırmızı kan hücrelerine geçtiğinde, kırmızı kan hücrelerinde bulunan bu enzim sayesinde CO2 çok hızlı bir şekilde karbonikasit dönüştürülür. Karbonikasit ise, proton H+ ve bikarbonat HCO3- iyonlarına ayrılarak tekrar kana geçer ve kan ph'sının 7,4'te dengelenmesini sağlayarak doğal bir tampon çözelti gibi çalışır.
Enzim glokom tedavisi için bu tür , ve gibi ilaçlar için bir hedeftir.
Tarihçe ve Sınıflandırma
Karbonik anhidraz ilk defa eritrositlerden 1933 yılında saflaştırılmış daha sonra yapılan yoğun çalışmalarda üç farklı tipte karakterize edilmiştir. Bunlardan hayvan ve bitki kökenli olanlar sırasıyla α ve β sınıfı içerisinde gruplandırılmışlardır. hepsinde ortak olan nokta aktif bölgelerinde bir çinko (Zn+2) iyonu bulundurmalarıdır.
İlk tespit edilmiş ve üzerinde en fazla çalışma yapılmış izoenzimleri bünyesinde bulunduran α-sınıfındaki enzimler monomerik yapıdadır. Çok az sayıda prokaryotik α-sınıfı karbonik anhidraz tespit edilmiştir. α-Sınıfı karbonik anhidrazların katalitik mekanizmasında aktif bölgeden protonun dış çözücü ortamına aktarılmasında His-64 birimi aracı rol oynamaktadır. Proton His-64’e onunla çinko atomu arasındaki su molekülleri aracılığıyla aktarılır. Yapılan çalışmalar Lys-91 ve Tyr-131 birimlerinin de proton transfer mekanizmasında rol aldığını göstermektedir.
β-Sınıfındakiler çiftler şeklinde dimerler, tetramerler, hekzamerler ve oktamerler halindedirler. Bu sınıfa ait ilk kristal yapı 2000 yılında bildirilmiştir. Önceleri sadece bitkilerde bulunduğu sanılan bu sınıftaki izoenzimler sonraları alg, bakteri ve türlerinde de tespit edilmiştir. Bu sınıftaki izoenzimlerde aktif bölgedeki Zn atomu iki sistein ve bir histidin ligandlarıyla bağlanmaktadır. Dizi analizleri bu sınıftaki izoenzimlerde yalnızca beş aminoasit biriminin ve aktif bölgede üç çinko ligandının, bir aspartat ve bir de arginin birimlerinin korunmuş olduğunu göstermektedir. Yakın zamanda β-sınıfındaki izoenzimlerin bitki tipi ve Cab tipi diye iki alt gruba ayrılabileceği savunulmaktadır. Buna sebep aralarındaki yapısal fark ve inhibitörlere karşı verilen cevaptaki farklar gösterilmektedir.
Üçüncü sınıf olan γ enzimleri trimer yapıda olup bu sınıfın yapısı aydınlatılmış tek üyesi 1994’te archaeon Methanosarcina thermophila’dan izole edilmiş izoenzimdir. İzole edilen bu izoenzimin çinko yerine kobalt kullanıldığında daha yüksek hidrataz aktivitesi gösterdiği ve p-nitrofenil asetatla esteraz aktivitesi göstermediği tespit edilmiştir. Metal bağlanma bölgesinde α-sınıfındaki gibi üç histidin birimi ligand oluşturmaktadır, ancak bunların ikisi bir monomere, bir tanesi ise bitişikteki monomere aittir.
Son zamanlarda ’den izole edilen karbonik anhidraz TWCA1’in diğer karbonik anhidraz sınıflarından ayrı bir sınıfa (δ-sınıfı) ait olduğu bildirilmiştir. TWCA1 diğer sınıflardaki karbonik anhidraz izoenzimlerine yapısal ve amino asit dizilişi bakımından benzememektedir.
Reaksiyon Mekanizması
Karbonik anhidrazın katalizlediği temel enzimatik olay karbondioksitin (CO2) hidrasyonudur.
CO2 + H2O --> HCO3- + H+
Kinetik çalışmalar bütün karbonik anhidraz izoenzimlerinde iki basamaklı bir mekanizmanın olduğunu göstermiştir. İlk basamakta (Reaksiyon 2) çinkoya bağlı hidroksit iyonunun CO2’e nükleofilik saldırısı gerçekleşmektedir. İkinci basamakta (Reaksiyon 3) ise çinkoya bağlı su molekülünün iyonlaşması ve protonun uzaklaştırılmasıyla aktif bölgenin tekrar oluşturulması olayları gerçekleşmektedir.
Zn2+-OH- + CO2 --> Zn2+ + HCO3-Reaksiyon 2
Zn2+ + H2O --> H+ + Zn2+-OH-Reaksiyon 3
Bu mekanizmada Reaksiyon 3 safhasının gerçekleşmesinde, protonun dış çözücü ortamına aktarılması için enzimin aktif bölgesindeki bir amino asit birimi proton taşıyıcı birim (PTB) olarak rol oynamaktadır. PTB aldığı protonu ortamdaki tampon (B) moleküllerine aktarmaktadır (Reaksiyon 4 ve 5).
PTB + Zn2+-H2O --> Zn2+-OH- + PTB-H+Reaksiyon 4
PTB-H+ + B --> PTB + B-H+Reaksiyon 5
Karbonik anhidraz II’nin katalizlediği enzimatik mekanizmada hız belirleyici basamak protonun aktif bölgeden uzaklaştırılması safhasıdır. Bu edenle aktif bölgedeki proton taşıma kapasitesine sahip amino asit birimleri aktivitede önemlidirler Aktivitede çinkonun dördüncü ligand pozisyonuna yakın bölgede bir hidrojen bağı alıcısının olması önemlidir.
Fonksiyonları
Karbonik anhidraz enzimi birçok fizyolojik olayda rol almaktadır. Bunlar arasında en önemlileri şöyle sıralanabilir:
1)
2) Kardiovasküler tonusun düzenlenmesi
3) Sindirim
4) Hücre bölümleri arasındaki iyon değişimi
5) Değişik enzimatik reaksiyonlar için gerekli bikarbonatın sağlanması
Enzim, hidrataz aktivitesi yanında esteraz aktivitesine de sahiptir, ancak fizyolojik açıdan hidrataz aktivitesi önemlidir. Bu sayede organizmanın asit – baz dengesinin düzenlenmesinde önemli rol üstlenir. Bu dengenin bozulduğu durumlarda, örneğin göz içi tansiyonunda, karbonik anhidraz enzim aktivitesine müdahale sıklıkla uygulanan bir tedavi yöntemidir. Bu açıdan karbonik anhidraz inhibitörleri klinik olarak önemli bileşiklerdir.
Karbonik Anhidraz Araştırmalarında Uygulanan Yöntemler
Karbonik anhidraz izoenzimlerinin biyolojik numunelerden izole edilmesinde, saflaştırılmasında ve karakterizasyonunda birçok kromatografik ve elektroforetik yöntem uygulanmıştır. Karbonik anhidrazın farklı izoformlarının farklı canlılardan ve dokulardan kromatografik ayrılmasında, uygulanan yöntemde farklılık arz etmektedir.
Karbonik Anhidraz İzoenzimlerinin Kromatografik Ayrılması
Karbonik anhidrazın memeli türlerinden izolasyonunda kaynak ve izoenzime göre farklı yöntem uygulanmaktadır. Üzerinde en fazla çalışma yapılmış olan izoenzimler sitoplazmik karbonik anhidraz I ve karbonik anhidraz II dir. Bu iki izoenzimin en kolay elde edilebilir kaynağı eritrositlerdir. Yapılan çalışmalarda eritrositlerde fazla miktarda bulunan hemoglobin, kloroform – etanol çöktürmesi, amonyum sülfat çöktürmesi ya da ısı ile denatürasyon yöntemleriyle uzaklaştırılabilmiştir. Bunların yanında üç-faz ayrışma yöntemide bir alternatif olmuştur. Bu yöntemde amonyum sülfat gibi bir tuz tert-butanol – su – protein karışımına ilave edilmiş ve böylece hemoglobin ve miyoglobin denatüre edilerek ayrılabilmiştir. Daha sonra amonyum sülfatın %90 doygunluğa ulaştırılmasıyla kalan proteinler jelimsi orta fazda toplanmıştır. Bu fazda karbonik anhidrazın yanında katalaz ve süperoksit dismütaz da bulunur. Karbonik anhidraz I ve II’nin izolasyonunda en çok kullanılan yöntem afinite kromatografisidir. İlk defa 1970 lerde uygulanmaya başlamış olan bu yöntemle sonraları karbonik anhidraz I ve II izoenzimleri başarılı bir şekilde birbirinden ayrılabilmiştir. Bu yöntemlerde destek maddesi olan jele enzimin güçlü bir şekilde bağlandığı inhibitörleri takılmakta ve enzimin bu moleküller aracılığıyla kolonda tutulması sağlanmaktadır. Bu anlamda en çok kullanılan inhibitör de sülfanilamiddir.
Mutasyon teknikleriyle hazırlanan inaktif karbonik anhidraz II’nin izolasyonunda inhibitörlerle bağlanmanın olmadığı durumlarda alternatif yöntemler uygulanmıştır. Önce %40 doygunlukta amonyum sülfat ile diğer safsızlıklar uzaklaştırılmış sonra %90 amonyum sülfat doygunluğunda insan karbonik anhidraz II çöktürülmüştür. Diyalizi takiben DEAE-Sephacel kolonundan geçirme ve sonra S-Sepharose ile kromatografi uygulanarak enzim %98 saflıkta elde edilmiştir. Bir grup araştırmacı da mutant enzim izolasyonunda S-Sepharose ile anyon değişimini, sonra fenil-Sepharose ile hidrofobik etkileşim kromatografisini ve son olarak da Sephacryl S-100 ile jel filtrasyonunu kullanmışlardır. Karbonik anhidraz III’ün afinite kromatografisinde kullanılan inhibitörlere bağlanmasının çok zayıf olmasından dolayı bu izoenzim önceleri farklı yöntemlerle izole edilmiştir. Sonraları bu izoenzimin p-aminobenzen sülfonamide yeteri derecede bağlandığı gösterilmiş ve bu inhibitör kullanılarak enzim afinite kromatografisi ile izole edilebilmiştir. Benzer şekilde membrana bağlı bir izoform olan karbonik anhidraz IV’te p-aminobenzen sülfonamid afinite kromatografisiyle izole edilmiştir.
Mitokondriyel bir enzim olan karbonik anhidraz V izolasyonunda, mitokondrilerin bütün sitosolik bileşenlerden ayrılmasını takiben dondurucuda bekletilip santrifüjlenmesi ve elde edilen tamamen çözünür durumdaki mitokondriyel matriks, p-aminobenzen sülfonamidin CM Biogel A’ya takılmasıyla hazırlanmış jelin bulunduğu kolondan geçirilmiştir. Daha sonra enzim sodyum azidür (NaN) ile elue edilerek başarılı bir şekilde izole edilmiştir.
Salgılanan bir enzim olan karbonik anhidraz VI, inhibitörlerle karbonik anhidraz II’ye benzer şekilde etkileşmektedir ve bu nedenle afinite kromatografisi izolasyon amacıyla rahatlıkla kullanılabilmiştir.
Memeli izoenzimlerinin haricinde diğer karbonik anhidraz izoformları da özellikle p-aminobenzen sülfonamid kullanılarak afinite kromatografisiyle izole edilebilmektedir. Bu izoenzimlerin izolasyonunda birçok farklı yöntem de uygulanmıştır. Bunlar arasında Sephadex G-75 ile jel-permeasyon kromatografisi, CM-selüloz katyon değişimi kromatografisi, DEAE Sephadex A-50 anyon değişimi kromatografisi, DEAE-selüloz kromatografisi, DEAE-hidroksilapatit kromatografisi sayılabilir. Bu yöntemler tek başlarına değil genellikle birkaç tanesi ardışık olarak uygulanmıştır. Bu yöntemlerin uygulandığı çalışmalarda istenmeyen proteinlerden kurtulmak için birinci basamakta etanol-kloroform çöktürmesi sıklıkla uygulanmaktadır.
Karbonik Anhidraz Çalışmalarında Elektroforetik Yöntemler
İzole edilen karbonik anhidraz izoenzimlerin tanınmasında ve saflığının kontrolünde elektroforetik yöntemler uygulanmaktadır. Çalışmanın amacına uygun olarak sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve normal (SDS’siz) PAGE en çok tercih edilen yöntemlerdir. SDS-PAGE’de enzim denatüre olduğu için enzimin doğal formda olması gerektiği çalışmalarda tercih edilmez. SDS-PAGE indirgeyen ve indirgemeyen tarzda iki şekilde uygulanabilmektedir. Bu da indirgenmenin olmasının istenmediği durumlarda önemli bir özelliktir. Karbonik anhidraz izoenzimlerinin karakterizasyonunda ayrıca diğer bazı yöntemler de mevcuttur. En çok kullanılanlar izoelektrik odaklama ve afinite elektroforezidir (10). İzoelektrik odaklama enzimler üzerinde meydana gelebilecek ikincil modifikasyonların tespitinde önemli bir araçtır. Bu yöntem ayrıca S-tiyollenmenin belirlenmesinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır (11). Afinite kromatografisinin elektroforezle birleştirilerek uygulandığı afinite elektroforezi ise daha çok inhibitörlerle yapılan kinetiğin ve denge sabitlerinin incelendiği çalışmalarda tercih edilmektedir. Bu yöntemlerde inhibitör jele tutturularak elektroforez uygulanmakta ve alınan yola göre bağlanma sabitleri belirlenmektedir. Bu yöntemde jel ile inhibitör arasında en az 20 Ao’luk bir uzatıcı kolun bulunmasının maksimum bağlanma için gerekli olduğu bilinmektedir.
Kaynakça
- ^ "Karbonik anhidraz". sciencedirect.com. 3 Ocak 2016 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 9 Nisan 2012..(İngilizce)
- ^ 17 Mayıs 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 10 Mart 2008.
- ^ Puscas, I., Puscas, C., Coltau, M., Baican, M., Domuta, G.: the serum of carcinoma patients powerfully activates carbonic anhydrase II. Experimental Oncology, 22: 162-164, September 2000.
- ^ Arslan, O., Nalbantoğlu, B., Demir, N., Özdemir, H., Küfrevioğlu, Ö. İ.: A new Method for the purification of carbonic anhydrase isozymes by affinity chromatography. Turkish Journal of Medical Sciences, 26: 163-166, 1996.[]
- ^ Backman, L. Binding of human carbonic anhydrase to human hemoglobin. Eur. J. Biochem., 120, 257-281, 1981.
- ^ Whitney, P.L. and Briggle, T.V. Membrane-associated carbonic anhydrase purified from bovine lung. J. Biol. Chem., 257, 12056-12059, 1982.[]
- ^ Storey, B.T., Dodgson, S.J. and Forster, R.E. Mitochondrial carbonic anhydrase: the purified enzyme. Ann. N.Y. Acad. Sci., 429, 210-211, 1984.
- ^ 23 Nisan 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 10 Mart 2008.
- ^ Vince, J.W. and Reithmeier, R. A. F.: Identification of the carbonic anhydrase II binding site in the Cl-/HCO3-anion exchanger AE1. Biochemistry, 39: 5527-5533, 2000.
- ^ Brady, H.J., Edwards, M., Linch, D.C., Knott, L., Barlow, J.H. and Butterworth, P.H. Expression of the human carbonic anhydrase I gene is activated late in fetal erythroid development and regulated by stage-specific trans-acting factors. Br. J. Haematol., 76, 135-142, 1985.
- ^ Chu, Y.H., Chen, J.K. and Whitesides, G.M. Affinity electrophoresis in multisectional polyacrylamide slab gels is a useful and convenient technique for measuring binding constants of aryl sulfonamides to bovine carbonic anhydrase B. Anal. Chem., 65, 1314-1322, 1993.
- ^ Lii, C.K., Chai, Y.C., Zhao, W., Thomas, J.A. and Hendrich, S. S-thiolation and irreversible oxidation of sulfhydryls on carbonic anhydrase III during oxidative stress: a method for studying protein modification in intact cells and tissues. Arch. Biochem. Biophys., 308, 231-239, 1994.
wikipedia, wiki, viki, vikipedia, oku, kitap, kütüphane, kütübhane, ara, ara bul, bul, herşey, ne arasanız burada,hikayeler, makale, kitaplar, öğren, wiki, bilgi, tarih, yukle, izle, telefon için, turk, türk, türkçe, turkce, nasıl yapılır, ne demek, nasıl, yapmak, yapılır, indir, ücretsiz, ücretsiz indir, bedava, bedava indir, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, resim, müzik, şarkı, film, film, oyun, oyunlar, mobil, cep telefonu, telefon, android, ios, apple, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, pc, web, computer, bilgisayar
Karbonik Anhidraz ya da karbonik dehidrataz aktif bolgesinde cinko Zn2 iyonu iceren bir ailesidir ve yavas bir reaksiyon olan karbondioksitin bikarbonat ve protona donusumunu katalizler Karbonik anhidraz bu reaksiyonun hizini ileri derecede artirarak saniyede 104 106 reaksiyon hizina ulastirir Kirmizi kan hucrelerinde hayvanlarin diger kisimlarinda ve bitkilerde bulunan karbonik asidi karbondioksit ve suyla parcalayan enzim Karbonik anhidrazInsan karbonik anhidrazi Serit diyagrami II merkezinde Cinko iyonu gorulmektedir TanimlayicilarEC numarasi 4 2 1 1CAS numarasi 9001 03 0VeritabanlariIntEnz viewBRENDA entryNiceZyme viewKEGG KEGG entrymetabolic pathwayprofilePDB structures RCSB PDB PDBj PDBe PDBsumAmiGO EGOAraPMC articlesPubMed articlesOkaryotik tipi karbonik anhidrazTanimlayicilarSembol Carb anhydraseDiger bilgilerReaksiyonCO2 H2O gt HCO3 H CO2 Difuzyonla kirmizi kan hucrelerine gectiginde kirmizi kan hucrelerinde bulunan bu enzim sayesinde CO2 cok hizli bir sekilde karbonikasit donusturulur Karbonikasit ise proton H ve bikarbonat HCO3 iyonlarina ayrilarak tekrar kana gecer ve kan ph sinin 7 4 te dengelenmesini saglayarak dogal bir tampon cozelti gibi calisir Enzim glokom tedavisi icin bu tur ve gibi ilaclar icin bir hedeftir Tarihce ve SiniflandirmaKarbonik anhidraz ilk defa eritrositlerden 1933 yilinda saflastirilmis daha sonra yapilan yogun calismalarda uc farkli tipte karakterize edilmistir Bunlardan hayvan ve bitki kokenli olanlar sirasiyla a ve b sinifi icerisinde gruplandirilmislardir hepsinde ortak olan nokta aktif bolgelerinde bir cinko Zn 2 iyonu bulundurmalaridir Ilk tespit edilmis ve uzerinde en fazla calisma yapilmis izoenzimleri bunyesinde bulunduran a sinifindaki enzimler monomerik yapidadir Cok az sayida prokaryotik a sinifi karbonik anhidraz tespit edilmistir a Sinifi karbonik anhidrazlarin katalitik mekanizmasinda aktif bolgeden protonun dis cozucu ortamina aktarilmasinda His 64 birimi araci rol oynamaktadir Proton His 64 e onunla cinko atomu arasindaki su molekulleri araciligiyla aktarilir Yapilan calismalar Lys 91 ve Tyr 131 birimlerinin de proton transfer mekanizmasinda rol aldigini gostermektedir b Sinifindakiler ciftler seklinde dimerler tetramerler hekzamerler ve oktamerler halindedirler Bu sinifa ait ilk kristal yapi 2000 yilinda bildirilmistir Onceleri sadece bitkilerde bulundugu sanilan bu siniftaki izoenzimler sonralari alg bakteri ve turlerinde de tespit edilmistir Bu siniftaki izoenzimlerde aktif bolgedeki Zn atomu iki sistein ve bir histidin ligandlariyla baglanmaktadir Dizi analizleri bu siniftaki izoenzimlerde yalnizca bes aminoasit biriminin ve aktif bolgede uc cinko ligandinin bir aspartat ve bir de arginin birimlerinin korunmus oldugunu gostermektedir Yakin zamanda b sinifindaki izoenzimlerin bitki tipi ve Cab tipi diye iki alt gruba ayrilabilecegi savunulmaktadir Buna sebep aralarindaki yapisal fark ve inhibitorlere karsi verilen cevaptaki farklar gosterilmektedir Ucuncu sinif olan g enzimleri trimer yapida olup bu sinifin yapisi aydinlatilmis tek uyesi 1994 te archaeon Methanosarcina thermophila dan izole edilmis izoenzimdir Izole edilen bu izoenzimin cinko yerine kobalt kullanildiginda daha yuksek hidrataz aktivitesi gosterdigi ve p nitrofenil asetatla esteraz aktivitesi gostermedigi tespit edilmistir Metal baglanma bolgesinde a sinifindaki gibi uc histidin birimi ligand olusturmaktadir ancak bunlarin ikisi bir monomere bir tanesi ise bitisikteki monomere aittir Son zamanlarda den izole edilen karbonik anhidraz TWCA1 in diger karbonik anhidraz siniflarindan ayri bir sinifa d sinifi ait oldugu bildirilmistir TWCA1 diger siniflardaki karbonik anhidraz izoenzimlerine yapisal ve amino asit dizilisi bakimindan benzememektedir Reaksiyon MekanizmasiKarbonik anhidrazin katalizledigi temel enzimatik olay karbondioksitin CO2 hidrasyonudur CO2 H2O gt HCO3 H Kinetik calismalar butun karbonik anhidraz izoenzimlerinde iki basamakli bir mekanizmanin oldugunu gostermistir Ilk basamakta Reaksiyon 2 cinkoya bagli hidroksit iyonunun CO2 e nukleofilik saldirisi gerceklesmektedir Ikinci basamakta Reaksiyon 3 ise cinkoya bagli su molekulunun iyonlasmasi ve protonun uzaklastirilmasiyla aktif bolgenin tekrar olusturulmasi olaylari gerceklesmektedir Zn2 OH CO2 gt Zn2 HCO3 Reaksiyon 2 Zn2 H2O gt H Zn2 OH Reaksiyon 3 Bu mekanizmada Reaksiyon 3 safhasinin gerceklesmesinde protonun dis cozucu ortamina aktarilmasi icin enzimin aktif bolgesindeki bir amino asit birimi proton tasiyici birim PTB olarak rol oynamaktadir PTB aldigi protonu ortamdaki tampon B molekullerine aktarmaktadir Reaksiyon 4 ve 5 PTB Zn2 H2O gt Zn2 OH PTB H Reaksiyon 4 PTB H B gt PTB B H Reaksiyon 5 Karbonik anhidraz II nin katalizledigi enzimatik mekanizmada hiz belirleyici basamak protonun aktif bolgeden uzaklastirilmasi safhasidir Bu edenle aktif bolgedeki proton tasima kapasitesine sahip amino asit birimleri aktivitede onemlidirler Aktivitede cinkonun dorduncu ligand pozisyonuna yakin bolgede bir hidrojen bagi alicisinin olmasi onemlidir FonksiyonlariKarbonik anhidraz enzimi bircok fizyolojik olayda rol almaktadir Bunlar arasinda en onemlileri soyle siralanabilir 1 2 Kardiovaskuler tonusun duzenlenmesi 3 Sindirim 4 Hucre bolumleri arasindaki iyon degisimi 5 Degisik enzimatik reaksiyonlar icin gerekli bikarbonatin saglanmasi Enzim hidrataz aktivitesi yaninda esteraz aktivitesine de sahiptir ancak fizyolojik acidan hidrataz aktivitesi onemlidir Bu sayede organizmanin asit baz dengesinin duzenlenmesinde onemli rol ustlenir Bu dengenin bozuldugu durumlarda ornegin goz ici tansiyonunda karbonik anhidraz enzim aktivitesine mudahale siklikla uygulanan bir tedavi yontemidir Bu acidan karbonik anhidraz inhibitorleri klinik olarak onemli bilesiklerdir Karbonik Anhidraz Arastirmalarinda Uygulanan YontemlerKarbonik anhidraz izoenzimlerinin biyolojik numunelerden izole edilmesinde saflastirilmasinda ve karakterizasyonunda bircok kromatografik ve elektroforetik yontem uygulanmistir Karbonik anhidrazin farkli izoformlarinin farkli canlilardan ve dokulardan kromatografik ayrilmasinda uygulanan yontemde farklilik arz etmektedir Karbonik Anhidraz Izoenzimlerinin Kromatografik Ayrilmasi Karbonik anhidrazin memeli turlerinden izolasyonunda kaynak ve izoenzime gore farkli yontem uygulanmaktadir Uzerinde en fazla calisma yapilmis olan izoenzimler sitoplazmik karbonik anhidraz I ve karbonik anhidraz II dir Bu iki izoenzimin en kolay elde edilebilir kaynagi eritrositlerdir Yapilan calismalarda eritrositlerde fazla miktarda bulunan hemoglobin kloroform etanol cokturmesi amonyum sulfat cokturmesi ya da isi ile denaturasyon yontemleriyle uzaklastirilabilmistir Bunlarin yaninda uc faz ayrisma yontemide bir alternatif olmustur Bu yontemde amonyum sulfat gibi bir tuz tert butanol su protein karisimina ilave edilmis ve boylece hemoglobin ve miyoglobin denature edilerek ayrilabilmistir Daha sonra amonyum sulfatin 90 doygunluga ulastirilmasiyla kalan proteinler jelimsi orta fazda toplanmistir Bu fazda karbonik anhidrazin yaninda katalaz ve superoksit dismutaz da bulunur Karbonik anhidraz I ve II nin izolasyonunda en cok kullanilan yontem afinite kromatografisidir Ilk defa 1970 lerde uygulanmaya baslamis olan bu yontemle sonralari karbonik anhidraz I ve II izoenzimleri basarili bir sekilde birbirinden ayrilabilmistir Bu yontemlerde destek maddesi olan jele enzimin guclu bir sekilde baglandigi inhibitorleri takilmakta ve enzimin bu molekuller araciligiyla kolonda tutulmasi saglanmaktadir Bu anlamda en cok kullanilan inhibitor de sulfanilamiddir Mutasyon teknikleriyle hazirlanan inaktif karbonik anhidraz II nin izolasyonunda inhibitorlerle baglanmanin olmadigi durumlarda alternatif yontemler uygulanmistir Once 40 doygunlukta amonyum sulfat ile diger safsizliklar uzaklastirilmis sonra 90 amonyum sulfat doygunlugunda insan karbonik anhidraz II cokturulmustur Diyalizi takiben DEAE Sephacel kolonundan gecirme ve sonra S Sepharose ile kromatografi uygulanarak enzim 98 saflikta elde edilmistir Bir grup arastirmaci da mutant enzim izolasyonunda S Sepharose ile anyon degisimini sonra fenil Sepharose ile hidrofobik etkilesim kromatografisini ve son olarak da Sephacryl S 100 ile jel filtrasyonunu kullanmislardir Karbonik anhidraz III un afinite kromatografisinde kullanilan inhibitorlere baglanmasinin cok zayif olmasindan dolayi bu izoenzim onceleri farkli yontemlerle izole edilmistir Sonralari bu izoenzimin p aminobenzen sulfonamide yeteri derecede baglandigi gosterilmis ve bu inhibitor kullanilarak enzim afinite kromatografisi ile izole edilebilmistir Benzer sekilde membrana bagli bir izoform olan karbonik anhidraz IV te p aminobenzen sulfonamid afinite kromatografisiyle izole edilmistir Mitokondriyel bir enzim olan karbonik anhidraz V izolasyonunda mitokondrilerin butun sitosolik bilesenlerden ayrilmasini takiben dondurucuda bekletilip santrifujlenmesi ve elde edilen tamamen cozunur durumdaki mitokondriyel matriks p aminobenzen sulfonamidin CM Biogel A ya takilmasiyla hazirlanmis jelin bulundugu kolondan gecirilmistir Daha sonra enzim sodyum azidur NaN ile elue edilerek basarili bir sekilde izole edilmistir Salgilanan bir enzim olan karbonik anhidraz VI inhibitorlerle karbonik anhidraz II ye benzer sekilde etkilesmektedir ve bu nedenle afinite kromatografisi izolasyon amaciyla rahatlikla kullanilabilmistir Memeli izoenzimlerinin haricinde diger karbonik anhidraz izoformlari da ozellikle p aminobenzen sulfonamid kullanilarak afinite kromatografisiyle izole edilebilmektedir Bu izoenzimlerin izolasyonunda bircok farkli yontem de uygulanmistir Bunlar arasinda Sephadex G 75 ile jel permeasyon kromatografisi CM seluloz katyon degisimi kromatografisi DEAE Sephadex A 50 anyon degisimi kromatografisi DEAE seluloz kromatografisi DEAE hidroksilapatit kromatografisi sayilabilir Bu yontemler tek baslarina degil genellikle birkac tanesi ardisik olarak uygulanmistir Bu yontemlerin uygulandigi calismalarda istenmeyen proteinlerden kurtulmak icin birinci basamakta etanol kloroform cokturmesi siklikla uygulanmaktadir Karbonik Anhidraz Calismalarinda Elektroforetik Yontemler Izole edilen karbonik anhidraz izoenzimlerin taninmasinda ve safliginin kontrolunde elektroforetik yontemler uygulanmaktadir Calismanin amacina uygun olarak sodyum dodesil sulfat poliakrilamid jel elektroforezi SDS PAGE ve normal SDS siz PAGE en cok tercih edilen yontemlerdir SDS PAGE de enzim denature oldugu icin enzimin dogal formda olmasi gerektigi calismalarda tercih edilmez SDS PAGE indirgeyen ve indirgemeyen tarzda iki sekilde uygulanabilmektedir Bu da indirgenmenin olmasinin istenmedigi durumlarda onemli bir ozelliktir Karbonik anhidraz izoenzimlerinin karakterizasyonunda ayrica diger bazi yontemler de mevcuttur En cok kullanilanlar izoelektrik odaklama ve afinite elektroforezidir 10 Izoelektrik odaklama enzimler uzerinde meydana gelebilecek ikincil modifikasyonlarin tespitinde onemli bir aractir Bu yontem ayrica S tiyollenmenin belirlenmesinde basarili bir sekilde kullanilmistir 11 Afinite kromatografisinin elektroforezle birlestirilerek uygulandigi afinite elektroforezi ise daha cok inhibitorlerle yapilan kinetigin ve denge sabitlerinin incelendigi calismalarda tercih edilmektedir Bu yontemlerde inhibitor jele tutturularak elektroforez uygulanmakta ve alinan yola gore baglanma sabitleri belirlenmektedir Bu yontemde jel ile inhibitor arasinda en az 20 Ao luk bir uzatici kolun bulunmasinin maksimum baglanma icin gerekli oldugu bilinmektedir Kaynakca Karbonik anhidraz sciencedirect com 3 Ocak 2016 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 9 Nisan 2012 Ingilizce 17 Mayis 2008 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 10 Mart 2008 Puscas I Puscas C Coltau M Baican M Domuta G the serum of carcinoma patients powerfully activates carbonic anhydrase II Experimental Oncology 22 162 164 September 2000 Arslan O Nalbantoglu B Demir N Ozdemir H Kufrevioglu O I A new Method for the purification of carbonic anhydrase isozymes by affinity chromatography Turkish Journal of Medical Sciences 26 163 166 1996 olu kirik baglanti Backman L Binding of human carbonic anhydrase to human hemoglobin Eur J Biochem 120 257 281 1981 Whitney P L and Briggle T V Membrane associated carbonic anhydrase purified from bovine lung J Biol Chem 257 12056 12059 1982 olu kirik baglanti Storey B T Dodgson S J and Forster R E Mitochondrial carbonic anhydrase the purified enzyme Ann N Y Acad Sci 429 210 211 1984 23 Nisan 2008 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 10 Mart 2008 Vince J W and Reithmeier R A F Identification of the carbonic anhydrase II binding site in the Cl HCO3 anion exchanger AE1 Biochemistry 39 5527 5533 2000 Brady H J Edwards M Linch D C Knott L Barlow J H and Butterworth P H Expression of the human carbonic anhydrase I gene is activated late in fetal erythroid development and regulated by stage specific trans acting factors Br J Haematol 76 135 142 1985 Chu Y H Chen J K and Whitesides G M Affinity electrophoresis in multisectional polyacrylamide slab gels is a useful and convenient technique for measuring binding constants of aryl sulfonamides to bovine carbonic anhydrase B Anal Chem 65 1314 1322 1993 Lii C K Chai Y C Zhao W Thomas J A and Hendrich S S thiolation and irreversible oxidation of sulfhydryls on carbonic anhydrase III during oxidative stress a method for studying protein modification in intact cells and tissues Arch Biochem Biophys 308 231 239 1994