DNA dizilemesi, bir DNA molekülündeki nükleotit bazlarının (adenin, guanin, sitozin ve timin) sırasının belirlenmesidir.
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTloTDJFeUwwTkNVRjlqYUdWdGFYTjBYM0psWVdSelgyRmZSRTVCWDNCeWIyWnBiR1V1YW5Cbkx6SXdNSEI0TFVOQ1VGOWphR1Z0YVhOMFgzSmxZV1J6WDJGZlJFNUJYM0J5YjJacGJHVXVhbkJuLmpwZw==.jpg)
DNA dizilerinin bilinmesi temel biyoloji, biyoteknoloji, , viroloji ve tıbbi tanı koyma gibi pek çok sahada vazgeçilmez hâle gelmiştir. DNA dizilemesi biyolojik araştırma ve keşifleri çok hızlandırmıştır. Sağlıklı ve mutasyona uğramış DNA dizilerinin karşılaştırılması, hasta tedavisine rehberlik edebilir, çeşitli kanserler dahil olmak üzere farklı hastalıkları teşhis edebilir, antikor repertuarını karakterize etmek için kullanılabilir. Modern DNA dizileme teknolojilerin mümkün kıldığı hızlı DNA dizileme sayesinde İnsan Genom Projesi'nde insan genomunun dizilenebilmiştir. Benzer projelerle pek çok hayvan, bitki ve mikrop genomunun tam dizisi üretilebilmiştir.
İlk DNA dizileri 1970'lerin başlarında üniversite araştırmacıları tarafından iki-boyutlu kromatografiye dayanan zahmetli yöntemlerle elde edilmiştir. DNA dizileyici, DNA dizileme sürecini otomatikleştirmek için kullanılan bilimsel bir araçtır. Bu aracı kullanılarak, floresan-tabanlı dizileme yöntemlerinin geliştirilmesinin ardından, DNA dizilemesi daha kolay ve çok daha hızlı hale gelmiştir.
Uygulamalar
Moleküler biyoloji
Moleküler biyolojide dizileme, genomu ve kodladığı proteinleri incelemek için kullanılır. Araştırmacıların dizilemeyi kullanarak elde ettikleri bilgiler, genlerdeki ve kodlamayan DNA'daki değişiklikleri tanımlamalarına ve potansiyel ilaç hedeflerini belirlemelerine olanak tanır.
Metagenomikler
Belirli bir ortamda bulunan organizmaları bilmek ekoloji, epidemiyoloji ve mikrobiyoloji araştırmaları için gereklidir. Bu nedenle metagenomik alanı, örneğin bir su kütlesi, atık su veya diğer kaynaklardan sürüntü numunelerinde bulunan organizmaların tanımlanmasını içerir.
Adli bilim
1984'te Alec Jeffreys, ailelerdeki genetik hastalıkları incelerken, DNA'nın tekrarlayan modellerinin ve değişken sayıda ardışık tekrarların (VNTR'ler) her insanda mevcut olduğunu fark etti. Her DNA modeli her bireyde farklıydı, bu da Jeffreys'in her bir DNA varyasyonunun belirli bir bireyi tanımlamak için kullanılabileceğini fark etmesine yol açtı. DNA dizileme, DNA profilleme yöntemleri ile birlikte adli kimlik tespiti ve babalık testi için kullanılabilir.
Viroloji
Çoğu virüs, ışık mikroskobuyla görülemeyecek kadar küçüktür, bu nedenle dizeleme, virüsü tanımlamak ve incelemek için virolojinin anlaşılmasına yardımcı olur. Genom dizilimi için RNA virüsleri, klinik numunelerde daha hızlı bozundukları için zamana daha duyarlıdır.
Temel ve klinik virüs dizileme araştırmalarında, yeni nesil dizileme ve geleneksel Sanger dizilemenin yanı sıra viral patojenlerin moleküler epidemiyolojisinde, ilaç direnci testi ve ortaya çıkan viral enfeksiyonların teşhisi için kullanılır. 'ta 2,3 milyondan fazla benzersiz viral dizi vardır.
Tarih
DNA yapısı ve işlevinin keşfi
1869 yılında, deoksiribonükleik asit (DNA) Friedrich Miescher tarafından keşfedildi ve izole edilmiştir. Yaşamın genetik planını DNA'nın değil proteinlerin tuttuğu düşünülmüştür. Buna bağlı olarak daha sonra saflaştırılmış DNA'nın bir bakteri türünü diğerine dönüştürebileceğini, Oswald Avery, Colin MacLeod ve Maclyn McCarty'nin deneyleri sonucunda bu düşünceler değişmişti. İlk kez DNA'nın hücrelerin özelliklerini dönüştürebildiği gösterilmiştir.
1953 yılında James Watson ve Francis Crick, Rosalind Franklin tarafından incelenen kristalize X-ışını yapılarına dayanan çift sarmallı DNA modelini önerdiler. Modele göre DNA, birbirinin etrafına dolanmış, zıt yönlerde uzanan ve hidrojen bağları ile birbirine bağlanmış iki nükleotit zincirinden oluşur. Adenin (A), sitozin (C), guanin (G) ve timin (T) olmak üzere her iplikçik dört tamamlayıcı nükleotitten oluşur. Bir iplikçikte A daima T ile eşleşir, C ise G ile eşleşir.
RNA dizileme
RNA dizilemesi nükleotit dizilemesinin en erken biçimlerinden oldu. RNA dizilemesinin en önemli aşamaları, Gent Üniversitesi'nden (Gent, Belçika) ve arkadaşlarının, 1972'de 'ye ait bir genin, daha sonra 1976'da ise aynı bakteriyofajın tüm genomunun dizisi olmuştur. Geleneksel RNA dizileme yöntemleri, dizilenmesi gereken bir cDNA molekülünün oluşturulmasını gerektirir.
Erken DNA dizileme yöntemleri
1970 yılında Cornell Üniversitesi'nde tarafından DNA dizisi belirleme için geliştirilen ilk yöntem, bölgeye özgü bir primer uzatma stratejisi içeriyordu. Lambda faj DNA'sının yapışkan uçlarını sıralamak için DNA polimeraz indüksiyonu ve nükleotide özgü işaretleme kullanıldı, bunların her ikisi de mevcut dizileme şemalarında belirgin bir şekilde öne çıkmaktadır. Wu, R. Padmanabhan ve meslektaşları, 1970 ve 1973 yılları arasında, bu yöntemin, sentetik bölgeye özgü primerler kullanarak herhangi bir DNA dizisini tanımlamak için kullanılabileceğini gösterdiler. MRC (Tıbbi Araştırma Konseyi merkezi), Cambridge, Birleşik Krallık'ta, Frederick Sanger daha sonra DNA dizilemesi için daha hızlı yöntemler geliştirmek üzere bu primer uzatma stratejisini benimsedi ve 1977'de "zincir sonlandırma inhibitörleri ile DNA dizilemesi" adlı bir yöntem yayınladı.Harvard Üniversitesi'nden Walter Gilbert ve , kimyasal bozunma yoluyla DNA dizilimini geliştirdiler. Dolaşan benek (wandering-spot) analizi olarak bilinen bir yöntemi kullanarak, 1973'te Gilbert ve Maxam 24 baz çiftinin dizisini bildirdiler.
İkinci nesil DNA dizileme
, ve Paul Neon, 1996 yılında "Termal Dizileme" adı verilen ve ikinci nesil DNA dizilemenin ortaya çıkışı olarak kabul edilen yeni bir DNA dizileme tekniğini tanıttı. Bu teknik, dizileme (sentez dizileme tekniği) sırasında pirofosfat sentezinden kaynaklanan lüminesans ölçümüne dayandığından, yüksek verimli dizileme olarak sınıflandırılabilir.
1998 yılında Solexa'yı kuran Shankar Balasubramanian ve David Kleinerman, floresan boyalar kullanan sentez yoluyla yeni bir dizileme yöntemi geliştirdiler. 2007 yılında Illumina, dünyada en yaygın kullanılan NGS teknolojisini sağlamak için yola çıkan ve bugüne kadar NGS platformlarında pazar lideri olan Solexa'yı satın aldı.
Maxam - Gilbert dizilemesi
1976-1977'de Harvard Üniversitesi'nden and Walter Gilbert, DNA'nın kimyasal modifikasyonu ve ardından onun spesifik bazlarda kesilmesi esasına dayanan bir DNA dizileme yöntemi geliştirdi. Maxam ve Gilbert kimyasal dizileme yöntemi hakkındaki makale, Sanger ve Coulson'un artı-eksi dizilemesi hakkındaki makalesinden iki yıl daha sonra yayınlamasına rağmen, Maxam-Gilbert dizilemesi daha popüler oldu. Bunun nedeni, Maxam-Gilbert yönteminde saflaştırılmış DNA'nın doğrudan dizilenebilmesi, buna karşın ilk Sanger yönteminde tek iplikli DNA üretilebilmesi için okunacak her DNA'nın ayrıca klonlanmasının gerekmesiydi. Ancak, zincir sonlandırma yönteminin zaman içinde iyileştirilmesiyle Maxam-Gilbert dizilemesi gözden düştü, zira teknik karmaşıklığı onun standart moleküler biyoloji kitlerinde kullanılmasına olanak vermiyordu, ayrıca zararlı kimyasallara gerek gösteriyordu ve ölçeklenmesinde zordu.
Bu yöntem DNA'nın 5' ucunun radyoaktif olarak işaretlenmesini (bu tipik olarak gamma-32P ATP kullanılan bir kinaz reaksiyonuydu) ve sonra dizilenecek DNA parçasının saflaştırılmasını gerektirir. Dört farklı kimyasal reaksiyonda (G, A+G, C, C+T) uygulanan kimyasal işlemlerle, moleküllerin ufak bir kısmında, DNA'yı oluşturan dört nükleotit bazdan biri veya ikisinde kesikler meydana gelir. Örneğin, pürinler formik asitle depürine edilir, guaninler (ve bir miktar adeninler de) ile metillenir, pirimidinler (C+T) hidrazin ile metillenir. Sadece-C reaksiyonunda, hidrazin reaksiyonuna tuz (sodyum klorür) eklenmesi timinin metillenmesini inhibe eder. Modifiye olmuş DNA'lar sonra sıcak ile modifiye olmuş bazların pozisyonunda kesilir. Modifikasyon yapan kimyasalların konsantrasyonu ayarlanarak DNA molekülü başına ortalama bir modifikasyon olması sağlanır. Böylece bir seri işaretlenmiş DNA parçası elde edilir, bu parçaların bir ucunda radyoaktif işaret, öbür ucunda ise ilk "kesik" yeri olur. Dört reaksiyonda meydana gelen parçalar, denatüran akrilamid jel içinde yan yana elektroforezle ayrıştırılır. Parçaları görselleştirmek için jel bir röntgen filminin üzerine konur, böylece her bir radyoaktif DNA parşasının bulunduğu yere karşılık gelen noktada fotoğraf filmi kararır. Filmde meydan gelen bant serilerinden DNA dizisi çıkarılabilir.
"Kimyasal dizileme" olarak bilinen bu yöntem daha sonradan DNA'ya bağlanan proteinlerin DNA'ya bağlanma yerlerini haritalamak için kullanılan Metilasyon Enterferans Ölçümü'nün temelini oluşturmuştur.
Zincir sonlandırma yöntemleri
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5akwyTmlMMU5sY1hWbGJtTnBibWN1YW5Cbi5qcGc=.jpg)
Zincir sonlandırma yöntemi (veya Sanger yöntemi, onu geliştiren Frederick Sanger'e atfen) Maxam ve Gilbert yöntemine kıyasla daha verimli olduğu, daha az toksik kimyasal ve radyoaktivite gerektirdiği için kısa sürede hızla yaygınlaştı. Sanger yönteminin ana ilkesi zincir sonladırıcı olarak trifosfatlar (ddNTP'ler) kullanılmasıdır.
Klasik zincir sonlandırma yöntemi için tek iplikli bir DNA kalıp, bir DNA , bir DNA polimeraz, normal deoksinükleotitfosfatlar (dNTP'ler) ve DNA zincir büyümesini sonladıran modifiye edilmiş nükleotitler (dideoksiNTP'ler veya kısaca ddNTP'ler) kullanılır. Bu ddNTP'ler otomatik dizileme makinalarında otomatik olarak tespit edilebilmek için radyokatif veya floresan olarak işaretlenir. DNA numunesi dört ayrı dizileme reaksiyonu için paylaştırılır, bunlarda ortak olarak standart (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP) ve DNA polimeraz bulunur. Her reaksiyona dört dideoksinükleotit'ten bir tanesi (ddATP, ddGTP, ddCTP veya ddTTP) eklenir. İki nükleotit arasında bir fosfodiester bağı oluşması için gerekli olan 3'-OH, dideoksinükleotitlerde bulunmadığı için bunları içeren bir DNA zinciri daha fazla uzayamayaz. Bu nedenle, çeşitli uzunluklarda DNA zincirlerinin oluşumuyla reaksiyon sona erer.
Yeni sentezlenen ve işaretlenen DNA parçaları ısıtılarak denatüre edilir ve jel elektroforeziyle büyüklüklerine göre ayrıştırılır. Dört reaksiyonun (A, C, G ve T) her birindeki DNA parçaları elektrik alanının etkisiyle jel içinde birbirine paralel ayrı yollardan (bu yollara şerit veya çizgi denir) ilerleyerek ayrıştırılır. Aynı uzunluğa sahip DNA parçları aynı hızda ilerler ve görselleştirildiklerinde ( veya mor ötesi ile) birer bant olarak görünürler. Sağdaki resimde jelin üzerine bir röntgen filmi konmuştur, siyah bantlar belli uzunluktaki DNA parçalarına karşılık gelir. Belli bir şeritteki karanlık bant, bir dideoksinükleotitin (ddATP, ddGTP, ddCTP veya ddTTP) zincire dahi edilmesi sonucu sonlanan bir DNA parçasıdır. Dört şeritteki farklı bantların göreceli konumlarına bakılarak DNA dizisi (alttan yukarı doğru) okunabilir.
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTlrTDJSbUwwUk9RVjlUWlhGMVpXNWphVzVmTTE5c1lXSmxiR2x1WjE5dFpYUm9iMlJ6TG1wd1p5OHlNakJ3ZUMxRVRrRmZVMlZ4ZFdWdVkybHVYek5mYkdGaVpXeHBibWRmYldWMGFHOWtjeTVxY0djPS5qcGc=.jpg)
Zincir sonlandırma dizilemesinin teknik çeşitlemeleri mevcuttur. Radyoaktif fosfor içeren nükleotitler kullanılarak yapılabilir veya 5' ucunda floresan boya ile işaretlenmiş bir primer kullanılabilir. Optik bir sistemde yapılan boya-primer dizilemesi sayesinde okuma daha hızlı ve ekonomik yapılabilir ve sistemin otomatizasyonu mümkün olur. ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu sistemler otomatik ve yüksek hacimli DNA dizilemesini mümkün kıldı.
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTh6THpOa0wxSmhaR2x2WVdOMGFYWmxYMFpzZFc5eVpYTmpaVzUwWDFObGNTNXFjR2N2TWpJd2NIZ3RVbUZrYVc5aFkzUnBkbVZmUm14MWIzSmxjMk5sYm5SZlUyVnhMbXB3Wnc9PS5qcGc=.jpg)
Zincir sonlandırması DNA dizilemesini son derece kolaylaştırmıştır. Örneğin, ticarî olarak elde edilebilen zincir sonlandırma kitlerinde dizileme yapmak için gerekli olan reaktantlar, taksim edilmiş ve kullanıma hazır şekilde bulunur. Yöntemin sınırlı kalabileceği durumlar, (1) primerin DNA'ya non-spesifik bağlanıp DNA dizisinin doğru okunamamasına neden olması ve (2) DNA'daki ikincil yapıların dizinin doğal haline etki etmesidir.
Boya sonlandırmalı dizileme
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTltTDJabEwwTkZYMEpoYzJsakxtcHdaeTh5TWpCd2VDMURSVjlDWVhOcFl5NXFjR2M9LmpwZw==.jpg)
Boya sonlandırmalı dizilemede (İng. Dye-terminator sequencing) zincir sonladırıcı ddNTP'lerin işaretlenir, böylece işaretlenmiş primer yönteminde olduğu gibi dört reaksiyon yerine, dizileme tek bir reaksiyon içinde yürütülebilir. Boya sonlandırma dizilemesinde dört dideoksinükleotit bitiricilerin her biri farklı floresan boyalarla işaretlidir, bunların her biri farklı dalga boylarında ışık salar.
Daha az işlem gerektirdiğinden ve daha hızlı çalıştığından dolayı, günümüzde otomatik dizileme makinalarının çoğunda boya sonlandırma dizilemesi yapılır. Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır, boya işaretli zincir sonlandırıcıların DNA parçasına dahil oluşunda boyadan boyaya farklar mevcuttur, bunun sonucu kapiler elektroforezde elde edilen dizi kromatogramındaki pik yükseklikleri ve şekilleri eşitsizlikler gösterir (soldaki şekle bakınız). Modifiye edilmiş DNA polimeraz enzim sistemleri ve DNA'ya dahil olmadaki çeşitliliği azaltan boyalar ile bu problem çözülmüştür. Boya sonlandırma yöntemi ile otomatize edilmiş yüksek hacimli DNA dizi analiz makinaları günümüzde dizileme projelerinin büyük çoğunluğunda kullanılmaktadır.
Zorluklar
DNA dizilemesinde sık rastlanan sorunlar arasında ilk 15-40 baz dizisinin kötü kaliteli olması ve 700-900 bazdan sonra dizileme kromatogramının kalitesinin kötüleşmesidir. (İng. Base calling) yazılımları (İng.quality trimming) için tipik olarak bir kalite değeri de verir.
DNA parçaları dizilemeden önce klonlanmışsa, elde edilen dizide ait kısımlar da olabilir. Buna karşın, PCR-temelli klonlama ve dayalı yeni dizileme teknolojilerinde klonlama vektörü olmaz. Ampliseq ve SeqSharp gibi tek adımlı Sanger dizileme (kombine amplifikasyon ve dizileme) yöntemleri sayesinde hedef genler klonlanmadan ve önceden çoğaltılmadan hızlı dizilenebilmektedir.
Mevcut yöntemler tek bir reaksiyonda sadece nispeten kısa (300-1000 nükleotit uzunlukta) DNA parçalarını doğrudan dizileyebilmektedir. Bu limitin üzerindeki DNA parçalarının dizilenmesindeki ana engel, uzunluk farkı bir nükleotit olan büyük DNA parçaları için ayrım gücünün yetersiz olmasıdır.
Otomasyon ve numune hazırlaması
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTg1THprNEwxTmhibWRsY2w5elpYRjFaVzVqYVc1blgzSmxZV1JmWkdsemNHeGhlUzV3Ym1jdk1qSXdjSGd0VTJGdVoyVnlYM05sY1hWbGJtTnBibWRmY21WaFpGOWthWE53YkdGNUxuQnVadz09LnBuZw==.png)
Otomatik DNA dizileme aletleri () bir defada 384 DNA numunesini dizileyebilir ve bu işlemi günde 24 kere tekrarlayabilir. DNA dizileyicileri, kapiler elektroforez kullanarak büyüklük ayrıştırması yapar, boya floresansının tespit ve kayıt eder ve floresan pik çizim kromatogramı olarak veri çıkarır. (İng. thermal cycler) ile dizileme reaksiyonlarının ardından temizleme ve bir tampon çözelti içinde yeniden çözeltme, sonra da dizileyiciye yükleme işlemleri ayrı ayrı yapılır. Düşük kaliteli DNA dizilerinin kırpılmasını otomatik olarak yapabilen çeşitli yazılımlar mevcuttur. Bu programlar her pikteki kaliteyi belirleyip, genelde dizinin sonlarında bulunan düşük kaliteli baz piklerini atarlar. Bu programların doğruluk derecesi insan operatörlerinkinden daha düşüktür ama çok büyük veri kümelerinin otomatik işlenmesi için yeterlidir.
Amplifikasyon ve klonal seleksiyon
![image](https://www.wikipedia.tr-tr.nina.az/image/aHR0cHM6Ly93d3cud2lraXBlZGlhLnRyLXRyLm5pbmEuYXovaW1hZ2UvYUhSMGNITTZMeTkxY0d4dllXUXVkMmxyYVcxbFpHbGhMbTl5Wnk5M2FXdHBjR1ZrYVdFdlkyOXRiVzl1Y3k5MGFIVnRZaTh5THpKa0wwUk9RVjlUWlhGMVpXNWphVzVuWDJkRVRrRmZiR2xpY21GeWFXVnpYM1J5TG1wd1p5OHlNakJ3ZUMxRVRrRmZVMlZ4ZFdWdVkybHVaMTluUkU1QlgyeHBZbkpoY21sbGMxOTBjaTVxY0djPS5qcGc=.jpg)
Büyük ölçekli dizilemenin amacı, kromozom gibi çok uzun DNA parçalarını dizilemektir. Yaygın kullanılan yollardan biri büyük DNA parçalarını restriksiyon enzimleri veya mekanik güçler kullanarak küçük parçalara ayırmaktır. Parçalanmış DNA bir içine klonlanır ve Escherichia coli içinde çoğaltılır. Her bir bakteriyel koloniden saflaştırılan kısa DNA parçaları ayrı ayrı dizilenir ve tek bir uzun, bitişik dizi şeklinde .
Bu yöntem DNA dizisi hakkında bir ön bilgi gerektirmez ve de novo dizileme olarak adlandırılır. Birleştirilmiş dizideki boşluklar yapılarak doldurulabilir. Farklı stratejilerin hız ve doğruluk açısından farklı avantajları vardır; (İng. shotgun sequencing) çoğu zaman büyük genomları dizilemekte kullanılır ama elde edilen verinin birleştirmesini yapmak karmaşık ve zordur, özellikle neden olduğu bölgelerde.
Çoğu dizileme yönteminde bireysel DNA moleküllerinin çoğaltılması için bir in vitro klonlama adımı kullanılır, çünkü moleküler tespit yöntemleri tekil moleküllerin dizilemesine yetecek duyarlıkta değildir. yönteminde bireysel DNA molekülleri ve primer kaplı boncuklarlar, yağ fazı içinde bulunan sulu damlacıklar içinde izole edilir. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile her boncuk DNA molekülünün klonal kopyaları ile kaplanır, sonra bu boncuklar daha sonra dizilemede kullanılmak üzere sabitlenir (immobilize edilir). Emülsiyon PCR Marguilis ve arkadaşları ( tarafından ticarileştirilmiştir), Shendure ve Porreca ve arkadaşları ( olarak bilinir) ve ( tarafından geliştirilmiştir, artık bünyesindedir).
In vitro klonal çoğaltma için kullanıla bir diğer yöntem (İng. bridge PCR) olarak adlandırılır, bunda DNA parçaları katı bir yüzeye bağlanmış primerler üzerinde çoğaltılır (bu yöntem Genome Analyzer makinasında kullanılır). Tek molekül yöntemleri (Stephen Quake'in laboratuvarında geliştirilen ve daha sonra tarafından ticarileştirilen) bir istisnadır: bu yöntemde parlak floresan boyalar ve lazer uyarımı kullanılarak bir yüzey üzerine sabitleştirilmiş bireysel DNA moleküllerindeki baz ekleme olayları tespit edilir, böylece moleküler çoğaltma gereği ortadan kalkar.
Yüksek hacimli dizileme
Düşük masraflı dizilemeye olan büyük talep, yüksek hacimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu teknolojilerde dizileme süreci paralelleştirilerek binlerce veya milyonlarca dizi aynı anda üretilir. Yüksek hacimli dizileme teknolojilerinin amacı, standart boya sonlandırma yöntemleri ile mümkün olan DNA dizileme masrafını azaltmaktır.
Lynx Therapeutics'in Kitlesel Paralel İmza Dizilemesi
"Gelecek kuşak" dizileme teknolojilerinin ilki olan Kitlesel Paralel İmza Dizilemesi (İng. Massively Parallel Signature Sequencing veya MPSS), 1990'larda Lynx Therapeutics'te geliştirilmiştir. Bu şirket 1992'de Sydney Brenner ve Sam Eletr tarafından kurulmuştur. MPSS, boncuk temelli bir yöntemdi, bir adaptör ligasyonu ve onu takip eden bir adaptör deşifrasyon adımı içeriyordu ve dizi dört nükleotitlik birimler halinde okunuyordu. Bu yöntem diziye özgü taraflılığa yol açıyordu ve spesifik dizilerin kaybına yol açıyordu. Teknoloji çok karmaşık olduğu için MPSS sadece Lynx Therapeutics tarafından bir hizmet olarak sunulmaktaydı ve dizileme makinası satılmıyordu. Daha sonradan Solexa ile şirket evliliği olunca bu teknoloji, gelişmesine yol açtı, çok daha basit olan bu yeni yaklaşım sayesinde MPSS kulanılmaz oldu. Ancak, MPSS çıktısının esas özellikleri daha sonra gelen "gelecek kuşak" (İng. "next gen") veri tiplerine çok benzemekteydi, yüzlerce bin sayıda kısa diziler üretmesi de dahil olmak üzere. MPSS durumunda, bu kısa diziler tipik olarak cDNA dizilemesinde, gen ifade düzeylerini ölçmek amacıyla kullanılıyordu. Lynx Therapeutics 2004'te Solexa ile birleşti ve bu şirket de daha sonra Illumina tarafından satın alındı.
Poloni dizilemesi
Harvard'da George Church'ün laboratuvarında geliştirilen poloni dizilemesi, 2005'te tüm bir genomu dizilemek için kullanılan ilk gelecek-kuşak dizileme sistemleri arasındaydı. In vitro Eşli etiket ("paired-tag") kitaplığı, emülsiyon PCR'si, otomatik bir mikroskop ve ligasyon-temelli dizileme kimyasını birleştirerek bir E. coli genomunu %99.9999'dan yüksek bir doğruluk üretebilmiş ve bunun maliyetini Sanger dizilemesinin yaklaşık 1/10'una getirmiştir. Bu teknoloji önce Agencourt Biosciences şirketine lisanslanmış, daha sonra ana şirketten ayrılan Agencourt Personal Genomics'e aktarılmış ve en nihayet Applied Biosystems'in SOLiD dizileme platformuna dahil edilmiştir.
454 pirodizilemesi
Pirodizilemenin paralelleştirilmiş bir versiyonu tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde bir yağ solüsyonu içindeki su damlacıklarında yer alan DNA, PCR ile çoğaltılır (emülsiyon PCR'si). Tek bir DNA kalıbının tek bir primer kaplı boncuğa bağlı olduğu her damlacık, sonra klonal bir koloni oluşturur. Dizileme makinası çok sayıda pikolitre hacimli kuyulara sahiptir, bunların her biri tek bir boncuk ve dizileme enzimleri içerir. Pirodizilemede enzimi kullanılır, bu enzimin ürettiği ışık ile büyümekte olan DNA'ya eklenen her bir nükleotitin tespit edilir. Veriler birleştirilerek dizi okumaları üretilir. Bu teknoloji orta uzunlukta diziler üretir, baz başına maliyeti Sanger dizilemesi ile SOLiD arasında yer alır.
Solexa dizilemesi
tersinir boya sonlandırıcılarına dayanan dizileme teknolojisini geliştirmiştir. DNA molekülleri bir lam üzerindeki primerlere bağlanır, sonra çoğaltılarak lokal, klonal koloniler oluştururlar (köprü amplifikasyonu). Dört tip ddNTP eklenir, dahil edilmeyen nükleotitler yıkanıp atılır. Pirodizilemeden farklı olarak, DNA ancak bir defada bir nükleotit kadar uzatılabilir. Bir kamera ile floresan işaretli nükleotitlerin resmi çekilir. Sonra 3' uçtaki bloker ve floresan boya beraberce kimyasal olarak çıkarılır ve bir sonraki döngü başlar.
SOLiD dizilemesi
'in SOLiD teknolojisinde yöntemi kullanılır. Burada, belli uzunluktaki tüm olası oligonükleotitlerin bir karışımı dizilenen konuma göre işaretlenir. Oligonükleotitler tavlanır ve ligasyona uğrar; DNA ligazın birbiriyle eşleşen dizileri bağlama tercihi nedeniyle, o pozisyon için bilgilendirici bir sinyal elde edilir. Dizilemeden önce DNA emülsiyon PCR ile çoğaltılır. Elde edilen boncukların her birinde aynı DNA'nın kopyaları bulunmaktadır, bu boncuklar bir cam lamın üzerine yerleştirilir. Sonuç, Illumina dizilemesine benzer sayı ve uzunluklarda dizilerdir.
İyon yarı iletken dizilemesi
Ion Torrent Systems Inc. dayalı bir sistem geliştirmiştir. Bu dizileme yöntemi, DNA'nın polimerizasyonu sırasında açığa çıkan tespitine dayalıdır. Dizilenecek bir kalıp DNA ipliği içeren bir mikrokuyu, tek bir nükleotit tipi ile doldurulur. Eğer eklenen nükleotit uzayan zincire dahil edilebiliyorsa bu bir hidrojen iyonunun salınmasına yol açar, bu da çok hassas bir iyon sensorunu uyarır. Eğer kalıp diziden aynı nükleotitten peşpeşe birkaç tane varsa (homopolimer tekrar), bir döngüde birden çok nükleotit zincire katılacaktır. Bu durumda daha çok sayıda hidrojen iyonu salınacak ve orantılı olarak daha yüksek bir elektronik sinyal elde edilecektir.
DNA nanotop dizilemesi
Complete Genomics şirketi tarafından geliştirilmiş bir dizileme teknolojisidir. Yöntem, kullanarak genomik DNA'dan elde edilmiş küçük parçaları çoğaltıp bunlardan DNA nanotopları meydana getirmektedir. Ligaz yoluyla dizileme ile nükleotit dizisi belirlenir. Bu yöntem bir defada çok sayıda DNA nanotoplarının dizilenmesini sağlar ve diğer gelecek-kuşak dizileme platformlarına kıyasla daha düşük rektant masrafı vardır. Ancak, her bir DNA nanotopundan sadece kısa diziler elde edilir, bu yüzden bu kısa dizilerin bir referans genomu üzerinde haritalanması zordur. Bu teknoloji çeşitli genom dizileme projelerinde uygulanmıştır.
Gelecek yöntemler
kullanan non-enzimatik bir yöntemdir. Dizisi belirlenecek olan bir DNA havuzu, floresan işaretlenip üzerinde bilinen diziler bulunan bir mikroçipe hibiridize edilir. Çip üzerinde belli bir noktada kuvvetli hibridizasyon sinyali olması, dizilenmekte olan DNA'da o dizinin bulunduğunu gösterir.Kütle spektrometresi zincir sonlandırma reaksiyonlarında meydana gelen DNA parçaları arasındaki kütle farklarının belirlenmesi için kullanılabilir.
Halen geliştirilmekte olan DNA dizileme yöntemleri arasında DNA polimerazın işaretlenmesi, DNA bir geçerken dizisinin okunması, ve ağır elementlerle (halojenler gibi) nükleotitleri işaretleyerek uzun DNA parçalarıdaki (>5,000 bp) bireysel nükleotitlerin yerlerini tespit etmeyi amaçlayan mikroskopi temelli teknikler ( veya ).
Ekim 2006'da (X Ödül Vakfı) tüm genom dizileme teknolojilerinin geliştirilmesine önayak olmak için 'nü ilan etti. Bu ödül "100 insan genomunu 10 gün veya daha kısa bir zamanda, dizilenen her 100.000 bazdan en fazla 1 hatalık bir doğrulukla, genomdaki dizilerin en az %98'ini içeren diziler üreten ve genom başına $10,000 (US) maliyete bunu yapabilen ekibe" $10 milyon ödül vadetmektedir.
2010 hibeleri ve 2011 adayları, mikroakışkan, poloni ve baz ağırlıklı dizileme metodolojilerinde devam eden çalışmaları içermektedir.
DNA dizilemesinde önemli aşamalar
- : yapısının keşfi.
- : Rekombinant DNA teknolojisinin keşfi. Bunun sayesinde tanımlı DNA parçalarının izolasyonu mümkün hâle gelmiştir. Bundan evvel dizilenebilen numeneler sadece bakteriyofaj veya virüs DNA'larıydı.
- : İlk dizilenen DNA genom .
- : ve Walter Gilbert "Kimyasal yıkım ile DNA dizilemesi" adlı makalelerini yayımladılar. Bağımsız olarak, Frederick Sanger, "Zincir sonlandırma inhibitörleri ile DNA dizilemesi" adlı makalesini yayımlıyor.
- : Britanya'da araştırmacıları Epstein-Barr virüsünün DNA dizisini (170 kb) yayımladılar .
- : California Institute of Technology'de 'un laboratuvarı ve Smith ilk yarı otomatik DNA dizileme makinasını ilan ettiler.
- : Applied Biosystems ilk tamamen otomatik otomatik dizileme makinası olan model ABI 370'ı pazarladı.
- : ABD Millî Sağlık kurumu (), Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans ve Saccharomyces cerevisiae için ilk büyük ölçekli denemelere başladı (baz başına US$0.75 masraf ile).
- : (İng. expressed sequence tag) dizilenmesi Craig Venter'in laboratuvarında başladı, insan genomunun kodlayıcı kısmını elde etmek amacıyla.
- : (TIGR)'da Craig Venter, Hamilton Smith ve arkadaşları doğada yaşayan bir organizmanın (Haemophilus influenzae bakterisinin) ilk genom dizisini yayımladılar. Dairesel kromozomda 1.830.137 baz bulunmaktaydı ve Science dergisinde yayımlanması tüm-genom saçma dizilime (whole-genome shotgun sequencing) yönteminin ilk kullanımı olmuştur, bu yöntem ile, daha evvelki dizileme projelerinde kullanılan baştan bir haritalama aşaması bertaraf edilmiştir.
- Stokholm'daki Kraliyet Teknoloji Enstitüsü'nden ve öğrencisi yöntemini yayınladılar
- University of Washington'dan Phil Green ve Brent Ewing, dizileyici veri analizi için
“”
yayımladılar. - : Lynx Therapeutics, paralelleştirilmiş, adaptör/ligasyon aracılıklı, boncuk tabanlı bir dizileme teknolojisi olan "MPSS"yi yayımladı ve pazarlayıp "gelecek kuşak" dizileme akımını başlattı.
- : insan genomunun taslak sürümü yayımlandı.
- : pirodizilemenin paralelleştirilmiş bir versiyonunu pazarladı. Makinalarının ilk sürümü, otomatik Sanger dizilemesine kıyasla dizileme masraflarını 6-kat azaltmakta ve MPSS'ninkinin ardından "gelecek kuşak" dizileme makinalarının ikincisiydi.
Kaynakça
- ^ a b c d "Heather, J. M., & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1-8. "Open archive"".
- ^ James Dewey Watson, Robert Mullan Cook-Deegan (1991). "Cook-Deegan, Robert Mullan (1991). "Origins of the Human Genome Project". FASEB Journal. University of Washington. 5 (1): 8–11. Open Source". The FASEB Journal.
- ^ Metzker, Michael L. (2005). ""Emerging technologies in DNA sequencing"". 15 (12). Genome research. s. 1767.
- ^ a b Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A (Şubat 2009). "Generations of sequencing technologies "Open Access"". Genomics. 93 (2). ss. 105-11. doi:10.1016/j.ygeno.2008.10.003. (PMID) 18992322.
- ^ "Molecular biology". Wikipedia. 1 Ocak 2004 tarihinde kaynağından arşivlendi.
- ^ "Metagenomics". Wikipedia. 18 Şubat 2005 tarihinde kaynağından arşivlendi.
- ^ "Forensic DNA analysis". Wikipedia. 11 Ocak 2019 tarihinde kaynağından arşivlendi.
- ^ Wohl, S., Schaffner, S. F., & Sabeti, P. C. (2016). "Genomic analysis of viral outbreaks". 3 (1). Annual review of virology. s. 173.
- ^ Milton W. Taylor (2014). "Introduction: a short history of virology". Springer. s. 1-22. 15 Ocak 2023 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 15 Ocak 2023.
- ^ "Chapter 40". Rodgers, M. H. (2020). Discovery of the Structure of DNA. Science, Technology, & Society: A Student-Led Exploration. "Open Source". 12 Ocak 2023 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 12 Ocak 2023.
- ^ Fatih Ozsolak and Patrice M. Milos (2011). "RNA sequencing: advances, challenges and opportunities". NIH Public Access.
- ^ . 8 Mart 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 12 Ocak 2023.
- ^ Jay, E., Bambara, R., Padmanabhan, R., & Wu, R. (1974). "DNA sequence analysis: a general, simple and rapid method for sequencing large oligodeoxyribonucleotide fragments by mapping". 1 (3). Nucleic Acids Research. s. 331.
- ^ a b c Ebertz, Dr Andreas (2 Kasım 2020). . The DNA Universe BLOG (İngilizce). 2 Kasım 2020 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 15 Ocak 2023.
- ^ a b Maxam AM, Gilbert W (Şubat 1977). "A new method for sequencing DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (2). ss. 560-4. doi:10.1073/pnas.74.2.560. (PMC) 392330 $2. (PMID) 265521.
- ^ Sanger F, Coulson AR (Mayıs 1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J. Mol. Biol. 94 (3). ss. 441-8. doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2. (PMID) 1100841.
- ^ Sanger F. Determination of nucleotide sequences in DNA 7 Aralık 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde .. Nobel lecture, 8 December 1980.
- ^ Graziano Pesole; Cecilia Saccone (2003). Handbook of comparative genomics: principles and methodology. New York: Wiley-Liss. s. 133. ISBN .
- ^ "Cold Spring Harb Protoc -- Sign In Page". 25 Temmuz 2011 tarihinde kaynağından .
- ^ "Cold Spring Harb Protoc -- Sign In Page". 25 Temmuz 2011 tarihinde kaynağından .
- ^ Smith LM, Sanders JZ, Kaiser RJ; ve diğerleri. (1986). "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis". Nature. 321 (6071). ss. 674-9. doi:10.1038/321674a0. (PMID) 3713851.
We have developed a method for the partial automation of DNA sequence analysis. Fluorescence detection of the DNA fragments is accomplished by means of a fluorophore covalently attached to the oligonucleotide primer used in enzymatic DNA sequence analysis. A different coloured fluorophore is used for each of the reactions specific for the bases A, C, G and T. The reaction mixtures are combined and co-electrophoresed down a single polyacrylamide gel tube, the separated fluorescent bands of DNA are detected near the bottom of the tube, and the sequence information is acquired directly by computer.
- ^ Smith LM, Fung S, Hunkapiller MW, Hunkapiller TJ, Hood LE (Nisan 1985). "The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5' terminus: synthesis of fluorescent DNA primers for use in DNA sequence analysis". Nucleic Acids Res. 13 (7). ss. 2399-412. doi:10.1093/nar/13.7.2399. (PMC) 341163 $2. (PMID) 4000959.
- ^ "Phred - Quality Base Calling". 26 Nisan 2015 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 24 Şubat 2011.
- ^ . 17 Haziran 2015 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 24 Şubat 2011.
- ^ DOI:10.1373/clinchem.2004.039164
- ^ DOI:10.2353/jmoldx.2010.090134
- ^ Richard Williams, Sergio G Peisajovich, Oliver J Miller, Shlomo Magdassi, Dan S Tawfik, Andrew D Griffiths (2006). "Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR". Nature methods. 3 (7). ss. 545-550. doi:10.1038/nmeth896. (PMID) 16791213.
- ^ a b Margulies M, Egholm M, Altman WE; ve diğerleri. (Eylül 2005). "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors". Nature. 437 (7057). ss. 376-80. doi:10.1038/nature03959. (PMC) 1464427 $2. (PMID) 16056220.
- ^ Shendure, J.; Porreca, GJ; Reppas, NB; Lin, X; McCutcheon, JP; Rosenbaum, AM; Wang, MD; Zhang, K; Mitra, RD (2005). "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome". Science. 309 (5741). s. 1728. doi:10.1126/science.1117389. (PMID) 16081699.
- ^ . 16 Mayıs 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 2 Haziran 2011.
- ^ Braslavsky I, Hebert B, Kartalov E, Quake SR (Nisan 2003). "Sequence information can be obtained from single DNA molecules". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (7). ss. 3960-4. doi:10.1073/pnas.0230489100. (PMC) 153030 $2. (PMID) 12651960.
- ^ Hall N (Mayıs 2007). "Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology". J. Exp. Biol. 210 (Pt 9). ss. 1518-25. doi:10.1242/jeb.001370. (PMID) 17449817.
- ^ Church GM (Ocak 2006). "Genomes for all". Sci. Am. 294 (1). ss. 46-54. doi:10.1038/scientificamerican0106-46. (PMID) 16468433.
- ^ Schuster, Stephan C. (2008). "Next-generation sequencing transforms today's biology". Nature methods. 5 (1). Nature Methods. ss. 16-18. doi:10.1038/nmeth1156. (PMID) 18165802.
- ^ Brenner, Sidney; Johnson, M; Bridgham, J; Golda, G; Lloyd, DH; Johnson, D; Luo, S; McCurdy, S; Foy, M (2000). "Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays". Nature Biotechnology. 18 (6). Nature Biotechnology. ss. 630-634. doi:10.1038/76469. (PMID) 10835600.
- ^ a b c Schuster SC (Ocak 2008). "Next-generation sequencing transforms today's biology". Nat. Methods. 5 (1). ss. 16-8. doi:10.1038/nmeth1156. (PMID) 18165802.
- ^ Mardis ER (2008). "Next-generation DNA sequencing methods". Annu Rev Genomics Hum Genet. Cilt 9. ss. 387-402. doi:10.1146/annurev.genom.9.081307.164359. (PMID) 18576944.
- ^ Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T; ve diğerleri. (Temmuz 2008). "A high-resolution, nucleosome position map of C. elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning". Genome Res. 18 (7). ss. 1051-63. doi:10.1101/gr.076463.108. (PMC) 2493394 $2. (PMID) 18477713.
- ^ Rusk, N. (2011). "Torrents of sequence." Nat Meth 8(1): 44-44.
- ^ . 6 Kasım 2012 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 20 Mart 2020.
- ^ Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads in Self-Assembling DNA Nanoarrays 2 Haziran 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde .. Drmanac, R. et. al. Science, 2010, 327 (5961): 78-81,
- ^ Genome Sequencing on Nanoballs 2 Haziran 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde . Porreca, JG. Nature Biotechnology, 2010, 28:(43-44)
- ^ Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reaads in Self-Assembling DNA Nanoarrays, Supplementary Material 2 Haziran 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde .. Drmanac, R. et. al. Science, 2010, 327 (5961):78-81,
- ^ Complete Genomics 25 Ağustos 2010 tarihinde Wayback Machine sitesinde . Press release, 2010
- ^ Hanna GJ, Johnson VA, Kuritzkes DR; ve diğerleri. (1 Temmuz 2000). "Comparison of sequencing by hybridization and cycle sequencing for genotyping of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase". J. Clin. Microbiol. 38 (7). ss. 2715-21. (PMC) 87006 $2. (PMID) 10878069. 15 Eylül 2019 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 2 Haziran 2011.
- ^ J.R. Edwards, H.Ruparel, and J. Ju (2005). "Mass-spectrometry DNA sequencing". Mutation Research. 573 (1-2). ss. 3-12. doi:10.1016/j.mrfmmm.2004.07.021. (PMID) 15829234.
- ^ . Visigenbio.com. 7 Eylül 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 15 Kasım 2009.
- ^ . Mcb.harvard.edu. 4 Haziran 2012 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 15 Kasım 2009.
- ^ "Nanopore Sequencing Could Slash DNA Analysis Costs". 21 Kasım 2011 tarihinde kaynağından .
- ^ US patent 20060029957, ZS Genetics, "Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components", çıkış tarihi: 2005-07-14
- ^ Xu M, Fujita D, Hanagata N (Aralık 2009). "Perspectives and challenges of emerging single-molecule DNA sequencing technologies". Small. 5 (23). ss. 2638-49. doi:10.1002/smll.200900976. (PMID) 19904762.
- ^ . 21 Nisan 2008 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 2 Haziran 2011.
- ^ . 19 Nisan 2003 tarihinde kaynağından arşivlendi.
- ^ Watson JD, Crick FH (1953). "The structure of DNA". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. Cilt 18. ss. 123-31. (PMID) 13168976.
- ^ Sanger F, Air GM, Barrell BG; ve diğerleri. (Şubat 1977). "Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA". Nature. 265 (5596). ss. 687-95. doi:10.1038/265687a0. (PMID) 870828.
- ^ Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (Aralık 1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12). ss. 5463-7. doi:10.1073/pnas.74.12.5463. (PMC) 431765 $2. (PMID) 271968.
- ^ Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD; ve diğerleri. (Haziran 1991). "Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project". Science. 252 (5013). ss. 1651-6. doi:10.1126/science.2047873. (PMID) 2047873.
- ^ Fleischmann RD, Adams MD, White O; ve diğerleri. (Temmuz 1995). "Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd". Science. 269 (5223). ss. 496-512. doi:10.1126/science.7542800. (PMID) 7542800. 26 Mart 2020 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 2 Haziran 2011.
- ^ M. Ronaghi, S. Karamohamed, B. Pettersson, M. Uhlen, and P. Nyren (1996). "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry. 242 (1). ss. 84-9. doi:10.1006/abio.1996.0432. (PMID) 8923969.
- ^ Ewing B, Green P (Mart 1998). . Genome Res. 8 (3). ss. 186-94. doi:10.1101/gr.8.3.186. (PMID) 9521922. 15 Eylül 2019 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 2 Haziran 2011.
- ^ Brenner S; ve diğerleri. (2000). "Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays". Nature Biotechnology. 18 (6). Nature Biotechnology. ss. 630-634. doi:10.1038/76469. (PMID) 10835600.
- ^ Lander ES, Linton LM, Birren B; ve diğerleri. (Şubat 2001). "Initial sequencing and analysis of the human genome". Nature. 409 (6822). ss. 860-921. doi:10.1038/35057062. (PMID) 11237011.
- ^ Venter JC, Adams MD, Myers EW; ve diğerleri. (Şubat 2001). "The sequence of the human genome". Science. 291 (5507). ss. 1304-51. doi:10.1126/science.1058040. (PMID) 11181995.
- ^ Stein RA (1 Eylül 2008). "Next-Generation Sequencing Update". Genetic Engineering & Biotechnology News. 28 (15). 18 Temmuz 2011 tarihinde kaynağından . Erişim tarihi: 2 Haziran 2011.
- ^ Margulies M, Egholm M, Altman WE; ve diğerleri. (Eylül 2005). "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors". Nature. 437 (7057). ss. 376-80. doi:10.1038/nature03959. (PMC) 1464427 $2. (PMID) 16056220.
wikipedia, wiki, viki, vikipedia, oku, kitap, kütüphane, kütübhane, ara, ara bul, bul, herşey, ne arasanız burada,hikayeler, makale, kitaplar, öğren, wiki, bilgi, tarih, yukle, izle, telefon için, turk, türk, türkçe, turkce, nasıl yapılır, ne demek, nasıl, yapmak, yapılır, indir, ücretsiz, ücretsiz indir, bedava, bedava indir, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, resim, müzik, şarkı, film, film, oyun, oyunlar, mobil, cep telefonu, telefon, android, ios, apple, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, pc, web, computer, bilgisayar
DNA dizilemesi bir DNA molekulundeki nukleotit bazlarinin adenin guanin sitozin ve timin sirasinin belirlenmesidir Bir DNA profilini inceleyen bir bilim insani DNA dizilerinin bilinmesi temel biyoloji biyoteknoloji viroloji ve tibbi tani koyma gibi pek cok sahada vazgecilmez hale gelmistir DNA dizilemesi biyolojik arastirma ve kesifleri cok hizlandirmistir Saglikli ve mutasyona ugramis DNA dizilerinin karsilastirilmasi hasta tedavisine rehberlik edebilir cesitli kanserler dahil olmak uzere farkli hastaliklari teshis edebilir antikor repertuarini karakterize etmek icin kullanilabilir Modern DNA dizileme teknolojilerin mumkun kildigi hizli DNA dizileme sayesinde Insan Genom Projesi nde insan genomunun dizilenebilmistir Benzer projelerle pek cok hayvan bitki ve mikrop genomunun tam dizisi uretilebilmistir Ilk DNA dizileri 1970 lerin baslarinda universite arastirmacilari tarafindan iki boyutlu kromatografiye dayanan zahmetli yontemlerle elde edilmistir DNA dizileyici DNA dizileme surecini otomatiklestirmek icin kullanilan bilimsel bir aractir Bu araci kullanilarak floresan tabanli dizileme yontemlerinin gelistirilmesinin ardindan DNA dizilemesi daha kolay ve cok daha hizli hale gelmistir UygulamalarMolekuler biyoloji Molekuler biyolojide dizileme genomu ve kodladigi proteinleri incelemek icin kullanilir Arastirmacilarin dizilemeyi kullanarak elde ettikleri bilgiler genlerdeki ve kodlamayan DNA daki degisiklikleri tanimlamalarina ve potansiyel ilac hedeflerini belirlemelerine olanak tanir Metagenomikler Belirli bir ortamda bulunan organizmalari bilmek ekoloji epidemiyoloji ve mikrobiyoloji arastirmalari icin gereklidir Bu nedenle metagenomik alani ornegin bir su kutlesi atik su veya diger kaynaklardan suruntu numunelerinde bulunan organizmalarin tanimlanmasini icerir Adli bilim 1984 te Alec Jeffreys ailelerdeki genetik hastaliklari incelerken DNA nin tekrarlayan modellerinin ve degisken sayida ardisik tekrarlarin VNTR ler her insanda mevcut oldugunu fark etti Her DNA modeli her bireyde farkliydi bu da Jeffreys in her bir DNA varyasyonunun belirli bir bireyi tanimlamak icin kullanilabilecegini fark etmesine yol acti DNA dizileme DNA profilleme yontemleri ile birlikte adli kimlik tespiti ve babalik testi icin kullanilabilir Viroloji Cogu virus isik mikroskobuyla gorulemeyecek kadar kucuktur bu nedenle dizeleme virusu tanimlamak ve incelemek icin virolojinin anlasilmasina yardimci olur Genom dizilimi icin RNA virusleri klinik numunelerde daha hizli bozunduklari icin zamana daha duyarlidir Temel ve klinik virus dizileme arastirmalarinda yeni nesil dizileme ve geleneksel Sanger dizilemenin yani sira viral patojenlerin molekuler epidemiyolojisinde ilac direnci testi ve ortaya cikan viral enfeksiyonlarin teshisi icin kullanilir ta 2 3 milyondan fazla benzersiz viral dizi vardir TarihDNA yapisi ve islevinin kesfi 1869 yilinda deoksiribonukleik asit DNA Friedrich Miescher tarafindan kesfedildi ve izole edilmistir Yasamin genetik planini DNA nin degil proteinlerin tuttugu dusunulmustur Buna bagli olarak daha sonra saflastirilmis DNA nin bir bakteri turunu digerine donusturebilecegini Oswald Avery Colin MacLeod ve Maclyn McCarty nin deneyleri sonucunda bu dusunceler degismisti Ilk kez DNA nin hucrelerin ozelliklerini donusturebildigi gosterilmistir 1953 yilinda James Watson ve Francis Crick Rosalind Franklin tarafindan incelenen kristalize X isini yapilarina dayanan cift sarmalli DNA modelini onerdiler Modele gore DNA birbirinin etrafina dolanmis zit yonlerde uzanan ve hidrojen baglari ile birbirine baglanmis iki nukleotit zincirinden olusur Adenin A sitozin C guanin G ve timin T olmak uzere her iplikcik dort tamamlayici nukleotitten olusur Bir iplikcikte A daima T ile eslesir C ise G ile eslesir RNA dizileme RNA dizilemesi nukleotit dizilemesinin en erken bicimlerinden oldu RNA dizilemesinin en onemli asamalari Gent Universitesi nden Gent Belcika ve arkadaslarinin 1972 de ye ait bir genin daha sonra 1976 da ise ayni bakteriyofajin tum genomunun dizisi olmustur Geleneksel RNA dizileme yontemleri dizilenmesi gereken bir cDNA molekulunun olusturulmasini gerektirir Erken DNA dizileme yontemleri 1970 yilinda Cornell Universitesi nde tarafindan DNA dizisi belirleme icin gelistirilen ilk yontem bolgeye ozgu bir primer uzatma stratejisi iceriyordu Lambda faj DNA sinin yapiskan uclarini siralamak icin DNA polimeraz induksiyonu ve nukleotide ozgu isaretleme kullanildi bunlarin her ikisi de mevcut dizileme semalarinda belirgin bir sekilde one cikmaktadir Wu R Padmanabhan ve meslektaslari 1970 ve 1973 yillari arasinda bu yontemin sentetik bolgeye ozgu primerler kullanarak herhangi bir DNA dizisini tanimlamak icin kullanilabilecegini gosterdiler MRC Tibbi Arastirma Konseyi merkezi Cambridge Birlesik Krallik ta Frederick Sanger daha sonra DNA dizilemesi icin daha hizli yontemler gelistirmek uzere bu primer uzatma stratejisini benimsedi ve 1977 de zincir sonlandirma inhibitorleri ile DNA dizilemesi adli bir yontem yayinladi Harvard Universitesi nden Walter Gilbert ve kimyasal bozunma yoluyla DNA dizilimini gelistirdiler Dolasan benek wandering spot analizi olarak bilinen bir yontemi kullanarak 1973 te Gilbert ve Maxam 24 baz ciftinin dizisini bildirdiler Ikinci nesil DNA dizileme ve Paul Neon 1996 yilinda Termal Dizileme adi verilen ve ikinci nesil DNA dizilemenin ortaya cikisi olarak kabul edilen yeni bir DNA dizileme teknigini tanitti Bu teknik dizileme sentez dizileme teknigi sirasinda pirofosfat sentezinden kaynaklanan luminesans olcumune dayandigindan yuksek verimli dizileme olarak siniflandirilabilir 1998 yilinda Solexa yi kuran Shankar Balasubramanian ve David Kleinerman floresan boyalar kullanan sentez yoluyla yeni bir dizileme yontemi gelistirdiler 2007 yilinda Illumina dunyada en yaygin kullanilan NGS teknolojisini saglamak icin yola cikan ve bugune kadar NGS platformlarinda pazar lideri olan Solexa yi satin aldi Maxam Gilbert dizilemesi1976 1977 de Harvard Universitesi nden and Walter Gilbert DNA nin kimyasal modifikasyonu ve ardindan onun spesifik bazlarda kesilmesi esasina dayanan bir DNA dizileme yontemi gelistirdi Maxam ve Gilbert kimyasal dizileme yontemi hakkindaki makale Sanger ve Coulson un arti eksi dizilemesi hakkindaki makalesinden iki yil daha sonra yayinlamasina ragmen Maxam Gilbert dizilemesi daha populer oldu Bunun nedeni Maxam Gilbert yonteminde saflastirilmis DNA nin dogrudan dizilenebilmesi buna karsin ilk Sanger yonteminde tek iplikli DNA uretilebilmesi icin okunacak her DNA nin ayrica klonlanmasinin gerekmesiydi Ancak zincir sonlandirma yonteminin zaman icinde iyilestirilmesiyle Maxam Gilbert dizilemesi gozden dustu zira teknik karmasikligi onun standart molekuler biyoloji kitlerinde kullanilmasina olanak vermiyordu ayrica zararli kimyasallara gerek gosteriyordu ve olceklenmesinde zordu Bu yontem DNA nin 5 ucunun radyoaktif olarak isaretlenmesini bu tipik olarak gamma 32P ATP kullanilan bir kinaz reaksiyonuydu ve sonra dizilenecek DNA parcasinin saflastirilmasini gerektirir Dort farkli kimyasal reaksiyonda G A G C C T uygulanan kimyasal islemlerle molekullerin ufak bir kisminda DNA yi olusturan dort nukleotit bazdan biri veya ikisinde kesikler meydana gelir Ornegin purinler formik asitle depurine edilir guaninler ve bir miktar adeninler de ile metillenir pirimidinler C T hidrazin ile metillenir Sadece C reaksiyonunda hidrazin reaksiyonuna tuz sodyum klorur eklenmesi timinin metillenmesini inhibe eder Modifiye olmus DNA lar sonra sicak ile modifiye olmus bazlarin pozisyonunda kesilir Modifikasyon yapan kimyasallarin konsantrasyonu ayarlanarak DNA molekulu basina ortalama bir modifikasyon olmasi saglanir Boylece bir seri isaretlenmis DNA parcasi elde edilir bu parcalarin bir ucunda radyoaktif isaret obur ucunda ise ilk kesik yeri olur Dort reaksiyonda meydana gelen parcalar denaturan akrilamid jel icinde yan yana elektroforezle ayristirilir Parcalari gorsellestirmek icin jel bir rontgen filminin uzerine konur boylece her bir radyoaktif DNA parsasinin bulundugu yere karsilik gelen noktada fotograf filmi kararir Filmde meydan gelen bant serilerinden DNA dizisi cikarilabilir Kimyasal dizileme olarak bilinen bu yontem daha sonradan DNA ya baglanan proteinlerin DNA ya baglanma yerlerini haritalamak icin kullanilan Metilasyon Enterferans Olcumu nun temelini olusturmustur Zincir sonlandirma yontemleriRadyoaktif isaretlenmis bir dizileme jeli Zincir sonlandirma yontemi veya Sanger yontemi onu gelistiren Frederick Sanger e atfen Maxam ve Gilbert yontemine kiyasla daha verimli oldugu daha az toksik kimyasal ve radyoaktivite gerektirdigi icin kisa surede hizla yayginlasti Sanger yonteminin ana ilkesi zincir sonladirici olarak trifosfatlar ddNTP ler kullanilmasidir Klasik zincir sonlandirma yontemi icin tek iplikli bir DNA kalip bir DNA bir DNA polimeraz normal deoksinukleotitfosfatlar dNTP ler ve DNA zincir buyumesini sonladiran modifiye edilmis nukleotitler dideoksiNTP ler veya kisaca ddNTP ler kullanilir Bu ddNTP ler otomatik dizileme makinalarinda otomatik olarak tespit edilebilmek icin radyokatif veya floresan olarak isaretlenir DNA numunesi dort ayri dizileme reaksiyonu icin paylastirilir bunlarda ortak olarak standart dATP dGTP dCTP ve dTTP ve DNA polimeraz bulunur Her reaksiyona dort dideoksinukleotit ten bir tanesi ddATP ddGTP ddCTP veya ddTTP eklenir Iki nukleotit arasinda bir fosfodiester bagi olusmasi icin gerekli olan 3 OH dideoksinukleotitlerde bulunmadigi icin bunlari iceren bir DNA zinciri daha fazla uzayamayaz Bu nedenle cesitli uzunluklarda DNA zincirlerinin olusumuyla reaksiyon sona erer Yeni sentezlenen ve isaretlenen DNA parcalari isitilarak denature edilir ve jel elektroforeziyle buyukluklerine gore ayristirilir Dort reaksiyonun A C G ve T her birindeki DNA parcalari elektrik alaninin etkisiyle jel icinde birbirine paralel ayri yollardan bu yollara serit veya cizgi denir ilerleyerek ayristirilir Ayni uzunluga sahip DNA parclari ayni hizda ilerler ve gorsellestirildiklerinde veya mor otesi ile birer bant olarak gorunurler Sagdaki resimde jelin uzerine bir rontgen filmi konmustur siyah bantlar belli uzunluktaki DNA parcalarina karsilik gelir Belli bir seritteki karanlik bant bir dideoksinukleotitin ddATP ddGTP ddCTP veya ddTTP zincire dahi edilmesi sonucu sonlanan bir DNA parcasidir Dort seritteki farkli bantlarin goreceli konumlarina bakilarak DNA dizisi alttan yukari dogru okunabilir Bir DNA parcasini isaretlemek icin 1 isaretlenmis primer ya 2 isaretlenmis dNTP ya da 3 isaretlenmis bir ddNTP kullanilabilir buyutmek icin tiklayin Zincir sonlandirma dizilemesinin teknik cesitlemeleri mevcuttur Radyoaktif fosfor iceren nukleotitler kullanilarak yapilabilir veya 5 ucunda floresan boya ile isaretlenmis bir primer kullanilabilir Optik bir sistemde yapilan boya primer dizilemesi sayesinde okuma daha hizli ve ekonomik yapilabilir ve sistemin otomatizasyonu mumkun olur ve arkadaslari tarafindan gelistirilen bu sistemler otomatik ve yuksek hacimli DNA dizilemesini mumkun kildi Radyoaktif dizileme ile floresan piklerin karsilastirmasi buyutmek icin tiklayin Zincir sonlandirmasi DNA dizilemesini son derece kolaylastirmistir Ornegin ticari olarak elde edilebilen zincir sonlandirma kitlerinde dizileme yapmak icin gerekli olan reaktantlar taksim edilmis ve kullanima hazir sekilde bulunur Yontemin sinirli kalabilecegi durumlar 1 primerin DNA ya non spesifik baglanip DNA dizisinin dogru okunamamasina neden olmasi ve 2 DNA daki ikincil yapilarin dizinin dogal haline etki etmesidir Boya sonlandirmali dizileme Kapiler elektroforez Boya sonlandirmali dizilemede Ing Dye terminator sequencing zincir sonladirici ddNTP lerin isaretlenir boylece isaretlenmis primer yonteminde oldugu gibi dort reaksiyon yerine dizileme tek bir reaksiyon icinde yurutulebilir Boya sonlandirma dizilemesinde dort dideoksinukleotit bitiricilerin her biri farkli floresan boyalarla isaretlidir bunlarin her biri farkli dalga boylarinda isik salar Daha az islem gerektirdiginden ve daha hizli calistigindan dolayi gunumuzde otomatik dizileme makinalarinin cogunda boya sonlandirma dizilemesi yapilir Bu yontemin bazi sinirlamalari vardir boya isaretli zincir sonlandiricilarin DNA parcasina dahil olusunda boyadan boyaya farklar mevcuttur bunun sonucu kapiler elektroforezde elde edilen dizi kromatogramindaki pik yukseklikleri ve sekilleri esitsizlikler gosterir soldaki sekle bakiniz Modifiye edilmis DNA polimeraz enzim sistemleri ve DNA ya dahil olmadaki cesitliligi azaltan boyalar ile bu problem cozulmustur Boya sonlandirma yontemi ile otomatize edilmis yuksek hacimli DNA dizi analiz makinalari gunumuzde dizileme projelerinin buyuk cogunlugunda kullanilmaktadir Zorluklar DNA dizilemesinde sik rastlanan sorunlar arasinda ilk 15 40 baz dizisinin kotu kaliteli olmasi ve 700 900 bazdan sonra dizileme kromatograminin kalitesinin kotulesmesidir Ing Base calling yazilimlari Ing quality trimming icin tipik olarak bir kalite degeri de verir DNA parcalari dizilemeden once klonlanmissa elde edilen dizide ait kisimlar da olabilir Buna karsin PCR temelli klonlama ve dayali yeni dizileme teknolojilerinde klonlama vektoru olmaz Ampliseq ve SeqSharp gibi tek adimli Sanger dizileme kombine amplifikasyon ve dizileme yontemleri sayesinde hedef genler klonlanmadan ve onceden cogaltilmadan hizli dizilenebilmektedir Mevcut yontemler tek bir reaksiyonda sadece nispeten kisa 300 1000 nukleotit uzunlukta DNA parcalarini dogrudan dizileyebilmektedir Bu limitin uzerindeki DNA parcalarinin dizilenmesindeki ana engel uzunluk farki bir nukleotit olan buyuk DNA parcalari icin ayrim gucunun yetersiz olmasidir Otomasyon ve numune hazirlamasi Bir boya sonlandirma dizileme okumasinin baslangici Otomatik DNA dizileme aletleri bir defada 384 DNA numunesini dizileyebilir ve bu islemi gunde 24 kere tekrarlayabilir DNA dizileyicileri kapiler elektroforez kullanarak buyukluk ayristirmasi yapar boya floresansinin tespit ve kayit eder ve floresan pik cizim kromatogrami olarak veri cikarir Ing thermal cycler ile dizileme reaksiyonlarinin ardindan temizleme ve bir tampon cozelti icinde yeniden cozeltme sonra da dizileyiciye yukleme islemleri ayri ayri yapilir Dusuk kaliteli DNA dizilerinin kirpilmasini otomatik olarak yapabilen cesitli yazilimlar mevcuttur Bu programlar her pikteki kaliteyi belirleyip genelde dizinin sonlarinda bulunan dusuk kaliteli baz piklerini atarlar Bu programlarin dogruluk derecesi insan operatorlerinkinden daha dusuktur ama cok buyuk veri kumelerinin otomatik islenmesi icin yeterlidir Amplifikasyon ve klonal seleksiyonGenomik DNA rastgele parcalara bolunup bakteriyel bir kitaplik icine klonlanir Bireysel bakteriyel klonlardan DNA dizilenir bu diziler birbiriyle ortusen kisimlarindan yararlanilarak birlestirilir Buyuk olcekli dizilemenin amaci kromozom gibi cok uzun DNA parcalarini dizilemektir Yaygin kullanilan yollardan biri buyuk DNA parcalarini restriksiyon enzimleri veya mekanik gucler kullanarak kucuk parcalara ayirmaktir Parcalanmis DNA bir icine klonlanir ve Escherichia coli icinde cogaltilir Her bir bakteriyel koloniden saflastirilan kisa DNA parcalari ayri ayri dizilenir ve tek bir uzun bitisik dizi seklinde Bu yontem DNA dizisi hakkinda bir on bilgi gerektirmez ve de novo dizileme olarak adlandirilir Birlestirilmis dizideki bosluklar yapilarak doldurulabilir Farkli stratejilerin hiz ve dogruluk acisindan farkli avantajlari vardir Ing shotgun sequencing cogu zaman buyuk genomlari dizilemekte kullanilir ama elde edilen verinin birlestirmesini yapmak karmasik ve zordur ozellikle neden oldugu bolgelerde Cogu dizileme yonteminde bireysel DNA molekullerinin cogaltilmasi icin bir in vitro klonlama adimi kullanilir cunku molekuler tespit yontemleri tekil molekullerin dizilemesine yetecek duyarlikta degildir yonteminde bireysel DNA molekulleri ve primer kapli boncuklarlar yag fazi icinde bulunan sulu damlaciklar icinde izole edilir Polimeraz zincir tepkimesi PCR ile her boncuk DNA molekulunun klonal kopyalari ile kaplanir sonra bu boncuklar daha sonra dizilemede kullanilmak uzere sabitlenir immobilize edilir Emulsiyon PCR Marguilis ve arkadaslari tarafindan ticarilestirilmistir Shendure ve Porreca ve arkadaslari olarak bilinir ve tarafindan gelistirilmistir artik bunyesindedir In vitro klonal cogaltma icin kullanila bir diger yontem Ing bridge PCR olarak adlandirilir bunda DNA parcalari kati bir yuzeye baglanmis primerler uzerinde cogaltilir bu yontem Genome Analyzer makinasinda kullanilir Tek molekul yontemleri Stephen Quake in laboratuvarinda gelistirilen ve daha sonra tarafindan ticarilestirilen bir istisnadir bu yontemde parlak floresan boyalar ve lazer uyarimi kullanilarak bir yuzey uzerine sabitlestirilmis bireysel DNA molekullerindeki baz ekleme olaylari tespit edilir boylece molekuler cogaltma geregi ortadan kalkar Yuksek hacimli dizilemeDusuk masrafli dizilemeye olan buyuk talep yuksek hacimli dizileme teknolojilerinin gelistirilmesine yol acmistir Bu teknolojilerde dizileme sureci paralellestirilerek binlerce veya milyonlarca dizi ayni anda uretilir Yuksek hacimli dizileme teknolojilerinin amaci standart boya sonlandirma yontemleri ile mumkun olan DNA dizileme masrafini azaltmaktir Lynx Therapeutics in Kitlesel Paralel Imza Dizilemesi Gelecek kusak dizileme teknolojilerinin ilki olan Kitlesel Paralel Imza Dizilemesi Ing Massively Parallel Signature Sequencing veya MPSS 1990 larda Lynx Therapeutics te gelistirilmistir Bu sirket 1992 de Sydney Brenner ve Sam Eletr tarafindan kurulmustur MPSS boncuk temelli bir yontemdi bir adaptor ligasyonu ve onu takip eden bir adaptor desifrasyon adimi iceriyordu ve dizi dort nukleotitlik birimler halinde okunuyordu Bu yontem diziye ozgu tarafliliga yol aciyordu ve spesifik dizilerin kaybina yol aciyordu Teknoloji cok karmasik oldugu icin MPSS sadece Lynx Therapeutics tarafindan bir hizmet olarak sunulmaktaydi ve dizileme makinasi satilmiyordu Daha sonradan Solexa ile sirket evliligi olunca bu teknoloji gelismesine yol acti cok daha basit olan bu yeni yaklasim sayesinde MPSS kulanilmaz oldu Ancak MPSS ciktisinin esas ozellikleri daha sonra gelen gelecek kusak Ing next gen veri tiplerine cok benzemekteydi yuzlerce bin sayida kisa diziler uretmesi de dahil olmak uzere MPSS durumunda bu kisa diziler tipik olarak cDNA dizilemesinde gen ifade duzeylerini olcmek amaciyla kullaniliyordu Lynx Therapeutics 2004 te Solexa ile birlesti ve bu sirket de daha sonra Illumina tarafindan satin alindi Poloni dizilemesi Harvard da George Church un laboratuvarinda gelistirilen poloni dizilemesi 2005 te tum bir genomu dizilemek icin kullanilan ilk gelecek kusak dizileme sistemleri arasindaydi In vitro Esli etiket paired tag kitapligi emulsiyon PCR si otomatik bir mikroskop ve ligasyon temelli dizileme kimyasini birlestirerek bir E coli genomunu 99 9999 dan yuksek bir dogruluk uretebilmis ve bunun maliyetini Sanger dizilemesinin yaklasik 1 10 una getirmistir Bu teknoloji once Agencourt Biosciences sirketine lisanslanmis daha sonra ana sirketten ayrilan Agencourt Personal Genomics e aktarilmis ve en nihayet Applied Biosystems in SOLiD dizileme platformuna dahil edilmistir 454 pirodizilemesi Pirodizilemenin paralellestirilmis bir versiyonu tarafindan gelistirilmistir Bu yontemde bir yag solusyonu icindeki su damlaciklarinda yer alan DNA PCR ile cogaltilir emulsiyon PCR si Tek bir DNA kalibinin tek bir primer kapli boncuga bagli oldugu her damlacik sonra klonal bir koloni olusturur Dizileme makinasi cok sayida pikolitre hacimli kuyulara sahiptir bunlarin her biri tek bir boncuk ve dizileme enzimleri icerir Pirodizilemede enzimi kullanilir bu enzimin urettigi isik ile buyumekte olan DNA ya eklenen her bir nukleotitin tespit edilir Veriler birlestirilerek dizi okumalari uretilir Bu teknoloji orta uzunlukta diziler uretir baz basina maliyeti Sanger dizilemesi ile SOLiD arasinda yer alir Solexa dizilemesi tersinir boya sonlandiricilarina dayanan dizileme teknolojisini gelistirmistir DNA molekulleri bir lam uzerindeki primerlere baglanir sonra cogaltilarak lokal klonal koloniler olustururlar kopru amplifikasyonu Dort tip ddNTP eklenir dahil edilmeyen nukleotitler yikanip atilir Pirodizilemeden farkli olarak DNA ancak bir defada bir nukleotit kadar uzatilabilir Bir kamera ile floresan isaretli nukleotitlerin resmi cekilir Sonra 3 uctaki bloker ve floresan boya beraberce kimyasal olarak cikarilir ve bir sonraki dongu baslar SOLiD dizilemesi in SOLiD teknolojisinde yontemi kullanilir Burada belli uzunluktaki tum olasi oligonukleotitlerin bir karisimi dizilenen konuma gore isaretlenir Oligonukleotitler tavlanir ve ligasyona ugrar DNA ligazin birbiriyle eslesen dizileri baglama tercihi nedeniyle o pozisyon icin bilgilendirici bir sinyal elde edilir Dizilemeden once DNA emulsiyon PCR ile cogaltilir Elde edilen boncuklarin her birinde ayni DNA nin kopyalari bulunmaktadir bu boncuklar bir cam lamin uzerine yerlestirilir Sonuc Illumina dizilemesine benzer sayi ve uzunluklarda dizilerdir Iyon yari iletken dizilemesi Ion Torrent Systems Inc dayali bir sistem gelistirmistir Bu dizileme yontemi DNA nin polimerizasyonu sirasinda aciga cikan tespitine dayalidir Dizilenecek bir kalip DNA ipligi iceren bir mikrokuyu tek bir nukleotit tipi ile doldurulur Eger eklenen nukleotit uzayan zincire dahil edilebiliyorsa bu bir hidrojen iyonunun salinmasina yol acar bu da cok hassas bir iyon sensorunu uyarir Eger kalip diziden ayni nukleotitten pespese birkac tane varsa homopolimer tekrar bir dongude birden cok nukleotit zincire katilacaktir Bu durumda daha cok sayida hidrojen iyonu salinacak ve orantili olarak daha yuksek bir elektronik sinyal elde edilecektir DNA nanotop dizilemesi Complete Genomics sirketi tarafindan gelistirilmis bir dizileme teknolojisidir Yontem kullanarak genomik DNA dan elde edilmis kucuk parcalari cogaltip bunlardan DNA nanotoplari meydana getirmektedir Ligaz yoluyla dizileme ile nukleotit dizisi belirlenir Bu yontem bir defada cok sayida DNA nanotoplarinin dizilenmesini saglar ve diger gelecek kusak dizileme platformlarina kiyasla daha dusuk rektant masrafi vardir Ancak her bir DNA nanotopundan sadece kisa diziler elde edilir bu yuzden bu kisa dizilerin bir referans genomu uzerinde haritalanmasi zordur Bu teknoloji cesitli genom dizileme projelerinde uygulanmistir Gelecek yontemlerkullanan non enzimatik bir yontemdir Dizisi belirlenecek olan bir DNA havuzu floresan isaretlenip uzerinde bilinen diziler bulunan bir mikrocipe hibiridize edilir Cip uzerinde belli bir noktada kuvvetli hibridizasyon sinyali olmasi dizilenmekte olan DNA da o dizinin bulundugunu gosterir Kutle spektrometresi zincir sonlandirma reaksiyonlarinda meydana gelen DNA parcalari arasindaki kutle farklarinin belirlenmesi icin kullanilabilir Halen gelistirilmekte olan DNA dizileme yontemleri arasinda DNA polimerazin isaretlenmesi DNA bir gecerken dizisinin okunmasi ve agir elementlerle halojenler gibi nukleotitleri isaretleyerek uzun DNA parcalaridaki gt 5 000 bp bireysel nukleotitlerin yerlerini tespit etmeyi amaclayan mikroskopi temelli teknikler veya Ekim 2006 da X Odul Vakfi tum genom dizileme teknolojilerinin gelistirilmesine onayak olmak icin nu ilan etti Bu odul 100 insan genomunu 10 gun veya daha kisa bir zamanda dizilenen her 100 000 bazdan en fazla 1 hatalik bir dogrulukla genomdaki dizilerin en az 98 ini iceren diziler ureten ve genom basina 10 000 US maliyete bunu yapabilen ekibe 10 milyon odul vadetmektedir 2010 hibeleri ve 2011 adaylari mikroakiskan poloni ve baz agirlikli dizileme metodolojilerinde devam eden calismalari icermektedir DNA dizilemesinde onemli asamalar yapisinin kesfi Rekombinant DNA teknolojisinin kesfi Bunun sayesinde tanimli DNA parcalarinin izolasyonu mumkun hale gelmistir Bundan evvel dizilenebilen numeneler sadece bakteriyofaj veya virus DNA lariydi Ilk dizilenen DNA genom ve Walter Gilbert Kimyasal yikim ile DNA dizilemesi adli makalelerini yayimladilar Bagimsiz olarak Frederick Sanger Zincir sonlandirma inhibitorleri ile DNA dizilemesi adli makalesini yayimliyor Britanya da arastirmacilari Epstein Barr virusunun DNA dizisini 170 kb yayimladilar California Institute of Technology de un laboratuvari ve Smith ilk yari otomatik DNA dizileme makinasini ilan ettiler Applied Biosystems ilk tamamen otomatik otomatik dizileme makinasi olan model ABI 370 i pazarladi ABD Milli Saglik kurumu Mycoplasma capricolum Escherichia coli Caenorhabditis elegans ve Saccharomyces cerevisiae icin ilk buyuk olcekli denemelere basladi baz basina US 0 75 masraf ile Ing expressed sequence tag dizilenmesi Craig Venter in laboratuvarinda basladi insan genomunun kodlayici kismini elde etmek amaciyla TIGR da Craig Venter Hamilton Smith ve arkadaslari dogada yasayan bir organizmanin Haemophilus influenzae bakterisinin ilk genom dizisini yayimladilar Dairesel kromozomda 1 830 137 baz bulunmaktaydi ve Science dergisinde yayimlanmasi tum genom sacma dizilime whole genome shotgun sequencing yonteminin ilk kullanimi olmustur bu yontem ile daha evvelki dizileme projelerinde kullanilan bastan bir haritalama asamasi bertaraf edilmistir Stokholm daki Kraliyet Teknoloji Enstitusu nden ve ogrencisi yontemini yayinladilar University of Washington dan Phil Green ve Brent Ewing dizileyici veri analizi icin yayimladilar Lynx Therapeutics paralellestirilmis adaptor ligasyon aracilikli boncuk tabanli bir dizileme teknolojisi olan MPSS yi yayimladi ve pazarlayip gelecek kusak dizileme akimini baslatti insan genomunun taslak surumu yayimlandi pirodizilemenin paralellestirilmis bir versiyonunu pazarladi Makinalarinin ilk surumu otomatik Sanger dizilemesine kiyasla dizileme masraflarini 6 kat azaltmakta ve MPSS ninkinin ardindan gelecek kusak dizileme makinalarinin ikincisiydi Kaynakca a b c d Heather J M amp Chain B 2016 The sequence of sequencers The history of sequencing DNA Genomics 107 1 1 8 Open archive James Dewey Watson Robert Mullan Cook Deegan 1991 Cook Deegan Robert Mullan 1991 Origins of the Human Genome Project FASEB Journal University of Washington 5 1 8 11 Open Source The FASEB Journal Metzker Michael L 2005 Emerging technologies in DNA sequencing 15 12 Genome research s 1767 a b Pettersson E Lundeberg J Ahmadian A Subat 2009 Generations of sequencing technologies Open Access Genomics 93 2 ss 105 11 doi 10 1016 j ygeno 2008 10 003 PMID 18992322 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Molecular biology Wikipedia 1 Ocak 2004 tarihinde kaynagindan arsivlendi Metagenomics Wikipedia 18 Subat 2005 tarihinde kaynagindan arsivlendi Forensic DNA analysis Wikipedia 11 Ocak 2019 tarihinde kaynagindan arsivlendi Wohl S Schaffner S F amp Sabeti P C 2016 Genomic analysis of viral outbreaks 3 1 Annual review of virology s 173 Milton W Taylor 2014 Introduction a short history of virology Springer s 1 22 15 Ocak 2023 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 15 Ocak 2023 Chapter 40 Rodgers M H 2020 Discovery of the Structure of DNA Science Technology amp Society A Student Led Exploration Open Source 12 Ocak 2023 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 12 Ocak 2023 Fatih Ozsolak and Patrice M Milos 2011 RNA sequencing advances challenges and opportunities NIH Public Access 8 Mart 2021 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 12 Ocak 2023 Jay E Bambara R Padmanabhan R amp Wu R 1974 DNA sequence analysis a general simple and rapid method for sequencing large oligodeoxyribonucleotide fragments by mapping 1 3 Nucleic Acids Research s 331 a b c Ebertz Dr Andreas 2 Kasim 2020 The DNA Universe BLOG Ingilizce 2 Kasim 2020 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 15 Ocak 2023 a b Maxam AM Gilbert W Subat 1977 A new method for sequencing DNA Proc Natl Acad Sci U S A 74 2 ss 560 4 doi 10 1073 pnas 74 2 560 PMC 392330 2 PMID 265521 Sanger F Coulson AR Mayis 1975 A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase J Mol Biol 94 3 ss 441 8 doi 10 1016 0022 2836 75 90213 2 PMID 1100841 Sanger F Determination of nucleotide sequences in DNA 7 Aralik 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde Nobel lecture 8 December 1980 Graziano Pesole Cecilia Saccone 2003 Handbook of comparative genomics principles and methodology New York Wiley Liss s 133 ISBN 0 471 39128 X Cold Spring Harb Protoc Sign In Page 25 Temmuz 2011 tarihinde kaynagindan Cold Spring Harb Protoc Sign In Page 25 Temmuz 2011 tarihinde kaynagindan Smith LM Sanders JZ Kaiser RJ ve digerleri 1986 Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis Nature 321 6071 ss 674 9 doi 10 1038 321674a0 PMID 3713851 We have developed a method for the partial automation of DNA sequence analysis Fluorescence detection of the DNA fragments is accomplished by means of a fluorophore covalently attached to the oligonucleotide primer used in enzymatic DNA sequence analysis A different coloured fluorophore is used for each of the reactions specific for the bases A C G and T The reaction mixtures are combined and co electrophoresed down a single polyacrylamide gel tube the separated fluorescent bands of DNA are detected near the bottom of the tube and the sequence information is acquired directly by computer KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Smith LM Fung S Hunkapiller MW Hunkapiller TJ Hood LE Nisan 1985 The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5 terminus synthesis of fluorescent DNA primers for use in DNA sequence analysis Nucleic Acids Res 13 7 ss 2399 412 doi 10 1093 nar 13 7 2399 PMC 341163 2 PMID 4000959 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Phred Quality Base Calling 26 Nisan 2015 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 24 Subat 2011 17 Haziran 2015 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 24 Subat 2011 DOI 10 1373 clinchem 2004 039164 DOI 10 2353 jmoldx 2010 090134 Richard Williams Sergio G Peisajovich Oliver J Miller Shlomo Magdassi Dan S Tawfik Andrew D Griffiths 2006 Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR Nature methods 3 7 ss 545 550 doi 10 1038 nmeth896 PMID 16791213 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link a b Margulies M Egholm M Altman WE ve digerleri Eylul 2005 Genome sequencing in microfabricated high density picolitre reactors Nature 437 7057 ss 376 80 doi 10 1038 nature03959 PMC 1464427 2 PMID 16056220 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Shendure J Porreca GJ Reppas NB Lin X McCutcheon JP Rosenbaum AM Wang MD Zhang K Mitra RD 2005 Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome Science 309 5741 s 1728 doi 10 1126 science 1117389 PMID 16081699 16 Mayis 2008 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 2 Haziran 2011 Braslavsky I Hebert B Kartalov E Quake SR Nisan 2003 Sequence information can be obtained from single DNA molecules Proc Natl Acad Sci U S A 100 7 ss 3960 4 doi 10 1073 pnas 0230489100 PMC 153030 2 PMID 12651960 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Hall N Mayis 2007 Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology J Exp Biol 210 Pt 9 ss 1518 25 doi 10 1242 jeb 001370 PMID 17449817 Church GM Ocak 2006 Genomes for all Sci Am 294 1 ss 46 54 doi 10 1038 scientificamerican0106 46 PMID 16468433 Schuster Stephan C 2008 Next generation sequencing transforms today s biology Nature methods 5 1 Nature Methods ss 16 18 doi 10 1038 nmeth1156 PMID 18165802 Brenner Sidney Johnson M Bridgham J Golda G Lloyd DH Johnson D Luo S McCurdy S Foy M 2000 Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing MPSS on microbead arrays Nature Biotechnology 18 6 Nature Biotechnology ss 630 634 doi 10 1038 76469 PMID 10835600 a b c Schuster SC Ocak 2008 Next generation sequencing transforms today s biology Nat Methods 5 1 ss 16 8 doi 10 1038 nmeth1156 PMID 18165802 Mardis ER 2008 Next generation DNA sequencing methods Annu Rev Genomics Hum Genet Cilt 9 ss 387 402 doi 10 1146 annurev genom 9 081307 164359 PMID 18576944 Valouev A Ichikawa J Tonthat T ve digerleri Temmuz 2008 A high resolution nucleosome position map of C elegans reveals a lack of universal sequence dictated positioning Genome Res 18 7 ss 1051 63 doi 10 1101 gr 076463 108 PMC 2493394 2 PMID 18477713 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Rusk N 2011 Torrents of sequence Nat Meth 8 1 44 44 6 Kasim 2012 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 20 Mart 2020 Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads in Self Assembling DNA Nanoarrays 2 Haziran 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde Drmanac R et al Science 2010 327 5961 78 81 Genome Sequencing on Nanoballs 2 Haziran 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde Porreca JG Nature Biotechnology 2010 28 43 44 Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reaads in Self Assembling DNA Nanoarrays Supplementary Material 2 Haziran 2013 tarihinde Wayback Machine sitesinde Drmanac R et al Science 2010 327 5961 78 81 Complete Genomics 25 Agustos 2010 tarihinde Wayback Machine sitesinde Press release 2010 Hanna GJ Johnson VA Kuritzkes DR ve digerleri 1 Temmuz 2000 Comparison of sequencing by hybridization and cycle sequencing for genotyping of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase J Clin Microbiol 38 7 ss 2715 21 PMC 87006 2 PMID 10878069 15 Eylul 2019 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 2 Haziran 2011 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link J R Edwards H Ruparel and J Ju 2005 Mass spectrometry DNA sequencing Mutation Research 573 1 2 ss 3 12 doi 10 1016 j mrfmmm 2004 07 021 PMID 15829234 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Visigenbio com 7 Eylul 2008 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 15 Kasim 2009 Mcb harvard edu 4 Haziran 2012 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 15 Kasim 2009 Nanopore Sequencing Could Slash DNA Analysis Costs 21 Kasim 2011 tarihinde kaynagindan US patent 20060029957 ZS Genetics Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components cikis tarihi 2005 07 14 Xu M Fujita D Hanagata N Aralik 2009 Perspectives and challenges of emerging single molecule DNA sequencing technologies Small 5 23 ss 2638 49 doi 10 1002 smll 200900976 PMID 19904762 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link 21 Nisan 2008 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 2 Haziran 2011 19 Nisan 2003 tarihinde kaynagindan arsivlendi Watson JD Crick FH 1953 The structure of DNA Cold Spring Harb Symp Quant Biol Cilt 18 ss 123 31 PMID 13168976 Sanger F Air GM Barrell BG ve digerleri Subat 1977 Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA Nature 265 5596 ss 687 95 doi 10 1038 265687a0 PMID 870828 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Sanger F Nicklen S Coulson AR Aralik 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A 74 12 ss 5463 7 doi 10 1073 pnas 74 12 5463 PMC 431765 2 PMID 271968 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Adams MD Kelley JM Gocayne JD ve digerleri Haziran 1991 Complementary DNA sequencing expressed sequence tags and human genome project Science 252 5013 ss 1651 6 doi 10 1126 science 2047873 PMID 2047873 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Fleischmann RD Adams MD White O ve digerleri Temmuz 1995 Whole genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd Science 269 5223 ss 496 512 doi 10 1126 science 7542800 PMID 7542800 26 Mart 2020 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 2 Haziran 2011 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link M Ronaghi S Karamohamed B Pettersson M Uhlen and P Nyren 1996 Real time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release Analytical Biochemistry 242 1 ss 84 9 doi 10 1006 abio 1996 0432 PMID 8923969 KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Ewing B Green P Mart 1998 Genome Res 8 3 ss 186 94 doi 10 1101 gr 8 3 186 PMID 9521922 15 Eylul 2019 tarihinde kaynagindan arsivlendi Erisim tarihi 2 Haziran 2011 Brenner S ve digerleri 2000 Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing MPSS on microbead arrays Nature Biotechnology 18 6 Nature Biotechnology ss 630 634 doi 10 1038 76469 PMID 10835600 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link Lander ES Linton LM Birren B ve digerleri Subat 2001 Initial sequencing and analysis of the human genome Nature 409 6822 ss 860 921 doi 10 1038 35057062 PMID 11237011 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Venter JC Adams MD Myers EW ve digerleri Subat 2001 The sequence of the human genome Science 291 5507 ss 1304 51 doi 10 1126 science 1058040 PMID 11181995 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link Stein RA 1 Eylul 2008 Next Generation Sequencing Update Genetic Engineering amp Biotechnology News 28 15 18 Temmuz 2011 tarihinde kaynagindan Erisim tarihi 2 Haziran 2011 Margulies M Egholm M Altman WE ve digerleri Eylul 2005 Genome sequencing in microfabricated high density picolitre reactors Nature 437 7057 ss 376 80 doi 10 1038 nature03959 PMC 1464427 2 PMID 16056220 KB1 bakim Digerlerinin yanlis kullanimi link KB1 bakim Birden fazla ad yazar listesi link